Development of highly productive and mammalian non-pathogenic recombinant avian influenza vaccine strains

Abstract

조류 인플루엔자 바이러스는 물새류에서 강한 전염성을 지닌 병원체이지만, 변이의 축적을 통해 종간 장벽을 넘어 포유류에 감염될 수 있다. 저병원성조류인플루엔자 바이러스 (Low pathogenic avian influenza viruses, LPAIVs)는 호흡기 증상과 산란율 저하 등 약한 임상 증상을 유발하지만 고병원성조류인플루엔자 바이러스 (highly pathogenic avian influenza viruses, HPAIVs)는 닭과 칠면조에서 심한 임상 증상을 일으키며, H5 아형의 HPAIV는 가금과 야생조류에서 대유행을 초래할 수 있다. 국내에서는 1999년 H9N2 LPAI의 재발생 이후 지속적으로 피해를 일으켰으며, 불활화 백신이 개발되어 농장에 성공적으로 적용되었다. 2003년 이후로는 7번의 H5 HPAIV가 발생하였으며, 살처분 정책이 시행되고 있으나 최근에는 긴급 백신 생산을 위한 백신주 배양액을 비축하고 있다. 불활화 조류인플루엔자 백신을 위한 백신주는 발육란에서 야외주를 적응시키거나 역유전학기술을 이용하여 재조합 바이러스로 작출되고 있다. Hoffmann의 역유전학 벡터시스템은 야외주의 hemagglutinin (HA)와 neuraminidase (NA)와 A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) 바이러스의 내부 유전자들(PB2, PB1/PB1-F2, PA/PA-X, NP, M1/M2, and N2/NEP genes)을 이용한 2 + 6 역유전학 체계를 가지고 있으며, 사람과 동물의 백신주 제작에 널리 사용되고 있다. PR8의 내부 유전자들이 생산성 좋은 재조합 바이러스 제작에 필요하지만 PB2, PA, NS1 유전자에는 포유류 병원성과 관련된 중요한 돌연변이들이 존재하고 있다. 또한, 일부 PR8 기반 재조합 백신주들은 발육란에서 불활화 백신주로 사용할 정도의 증식성을 보이지 않는다. 더 효과적인 백신주를 만들기 위해서는 야외주의 내부 유전자에 존재하는 T cell과 B cell epitope들을 맞춰주는 것이 좋지만, 야외주의 8개 게놈을 모두 갖는 재조합 바이러스의 작출은 늘 성공적인 것은 아니다. 상업용 백신주인 A/chicken/Korea/310_E20//2001(H9N2) (01310)은 발육란에서 20번의 계대를 통해 확립되었으며, 높은 증식성과 동시에 높은 계태아 병원성을 획득했다. 높은 병원성은 계태아의 조기 폐사를 유발하며 요막액의 수득량을 감소시켜 바이러스의 생산성을 떨어뜨린다. 01310 PB2 유전자는 포유류 병원성이 없는 원시유전자(prototypic gene)로 293T 세포주에서의 01310의 8개 게놈을 갖는 재조합 바이러스의 작출은 불가능했다. Hoffmann의 벡터시스템은 바이러스 게놈 RNA의 3-말단에 존재하는 프로모터 조성이 polymerase (PB1, PB2, PA) 게놈은 약한 프로모터 (4번째 염기가 cytidine, C4)이고, 그 외의 게놈은 강한 프로모터 (4번째 염기가 Uridine, U4) 이다. 01310의 작출이 어려운 문제를 해결하기 위해서 polymerase 유전자의 promoter를 C4에서 U4로 변경하여 293T 세포주에서의 약한 PB2의 활성을 보완한 결과 성공적으로 바이러스를 작출하였다. 또한, 01310의 NS1/NEP 유전자를 계태아에 병원성이 없는 A/chicken/Korea/KBNP-0028/2000 (H9N2) (0028) 바이러스에서 유래한 포유류 무병원성 NS1/NEP 유전자로 교체한 재조합 01310 바이러스 (r310-NS28)를 작출하였다. r310-NS28은 증가한 계태아 평균폐사시간을 보여 계태아 병원성이 감소했고, 요막액 수득량 증가로 인한 총 항원량 증가로 생산성이 향상되었다. 포유류 병원성과 관련된 G139D/N, S151T, GSEV에서 EPEV로의 돌연변이들은 0028의 NS1/NEP 유전자에 이식한 경우 계태아 병원성이 증가하였다. Clade 2.3.4.4 H5Nx HPAIVs는 전세계적으로 확산되었으며, clade 2.3.4.4a H5N8 바이러스는 국내 비상용 백신주로 선발되었다. 그러나 기존방식의 PR8 기반 재조합 H5N8 백신주는 발육란에서 낮은 증식성을 보였고, 마우스의 폐에서 증식할 수 있어 잠재적인 병원성을 보유하고 있다. 이러한 문제들을 해결하기 위해 우선 선행연구를 통해 발육란 고증식성과 관련된 돌연변이(HA 유전자의 H103Y, K161E, L317P 변이와 NA 유전자에서 S369N 변이)를 갖는 재조합 H5N8 바이러스들을 작출하여 발육란에서의 증식성을 비교하였다. 그 결과 H103Y 변이만이 유의적으로 바이러스 역가를 증가시켰으나 포유류 병원성 또한 증가시켰다. H103Y는 HA의 내산성과 내열성을 증가시키며 조류인플루엔자 바이러스의 포유류 호흡기 전염성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 그러나 PR8의 PB2 유전자를 01310의 유전자로 교체한 결과 증가된 포유류 병원성이 성공적으로 제거되었다. 이렇게 최적화된 재조합 H5N8 바이러스로 사독오일백신을 제조하여 닭에 접종한 결과 이종인 clade 2.3.4.4 H5N6 HPAIV 공격 접종 시 폐사를 완벽하게 방어하였고, 오리에서 주령에 비례하는 체액성 면역을 유도하였다. HPAIVs에 대한 지속적인 백신 접종은 항원성 변이주 출현을 촉발한다는 사실이 보고되어 있으므로 미래의 HPAIV 백신주 개발과 백신 프로그램을 위한 전략을 탐색하고자 H5N1 HPAIV의 진화 과정을 분석하였다. Clade 2.3.2.1c H5N1 HPAIVs는 백신으로 형성된 면역 하에서 clade 2.3.2로부터 진화해 왔으므로 바이러스 분리 시기에 따른 HA 단백질 아미노산 서열(n=647)의 변화를 분석하였다. 그 결과 Clade 2.3.2.1c H5N1 HPAIVs의 HA 단백질은 진화 과정에서 수용체 결합 부위 근처에서 S144N과 V223I 돌연변이를 순서대로 획득하였다. S144N 돌연변이로 144N-linked glycosylation site (NGS)가 새로 생성되는데 데이터베이스의 H5 아형의 HA 단백질 서열을 분석한 결과 158NGS 보다 144NGS의 빈도가 유의적으로 높으므로 자연계에서는 144NGS가 덜 선호되는 것으로 추정하였다. 144N과 158N은 서로 다른 에피톱에 위치하며 이들에 당쇄 결합이 일어나는 경우 인근 에피톱을 가려 체액성 면역을 회피하게 된다. 따라서 144NGS의 획득은 백신 면역 회피 과정에서 나타난 인공적인 결과로 추정된다. 단일 역변이 (N144S 또는 I223V)와 조합 역변이 (N144S와 I223V)를 적용한 재조합 clade 2.3.2.1c H5N1 바이러스를 제작하여 특성을 분석하였다. 그 결과 단일 역변이를 갖는 재조합 바이러스들은 낮은 바이러스 역가와 조류 수용체 결합력을 보였으나, 조합 역변이는 높은 발육란과 포유류세포주에서의 증식성과 마우스 병원성을 보였다. V223I 돌연변이는 HA 단백질의 내열성을 매우 감소시켰는데 223번 아미노산의 위치상 heterotrimer간 상호작용을 불안정화 시키기 때문인 것으로 추정되었다. 따라서 clade 2.3.2.1c H5N1 HPAIVs는 조류 면역을 회피하고자 진화하였으나 그 대가로 바이러스의 fitness와 포유류 병원성을 잃은 것으로 판단된다. 본 연구에서는 재조합 백신주의 효능과 병원성에 영향을 주는 Hoffmann 벡터시스템의 내재적 결함과 한계를 바이러스 게놈 3-말단의 promoter 변경과 조류인플루엔자 바이러스 유래의 저병원성 PB2, NS1/NEP 유전자로 PR8의 해당 유전자를 대체함으로써 개선하였다. 닭과 포유류에서 공통적으로 관찰되는 NS1과 H103Y의 기능은 닭이 조류인플루엔자 바이러스의 포유류 병원성 진화에 중요하다는 것을 의미한다. 본 연구에서 개발한 발육란 고생산성, 포유류 무병원성 H9N2 및 clade 2.3.4.4 H5N8 백신주는 효과적인 백신 생산에 유용하며 clade 2.3.2.1c 바이러스 연구로부터 얻은 실험 및 생물정보학 데이터는 향후 보다 개선된 백신주 개발에 활용할 수 있다.

Avian influenza viruses (AIVs) are highly infectious pathogen of waterfowls and can overcome species barriers to infect mammals by acquiring cumulative mutations. Low pathogenic avian influenza viruses (LPAIVs) cause mild or moderate clinical symptoms, and highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIVs) cause severe clinical symptoms in domestic poultry. Many subtype H5 HPAIVs have caused pandemics in poultry and wild birds. In Korea, H9N2 LPAIVs have caused continuous problems like decreased egg production since recurrent outbreaks in 1999 and an inactivated vaccine has been successfully applied in the field. Since 2003, seven epidemics caused by H5Nx HPAIVs have occurred and stamping out policy has been conducted. However, stockpiling of HPAI antigen bank for emergency vaccine production has established in Korea since 2018. Recently, vaccine strains for inactivated avian influenza vaccines have been generated by adaptation of field AIVs to embryonated chicken eggs (ECEs) or by reverse genetics technique. The Hoffmanns vector system adopts 2+6 reverse genetics scheme using hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) genomes of field AIVs and 6 internal genomes coding PB2, PB1/PB1-F2, PA/PA-X, NP, M1/M2, and N2/NEP of A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) strain, and has been broadly used for generation of productive vaccine strains. Although the PR8 internal genes are necessary for generation of productive recombinant virus, they possess important mammalian pathogenicity-related mutations in PB2, PA and NS1 genes. In addition, some of PR8-derived recombinant vaccine strains doesnt show enough replication efficiency in ECEs to be a inactivated vaccine strain. To generate more efficacious vaccine strains, it is recommended to match T and B cell epitopes of internal proteins to field strains for better protection, but in some cases rescue of recombinant virus possessing 8 genomes of field strain was unsuccessful. Since 2007, a commercial LPAI vaccine strain A/chicken/310_E20//2001(H9N2) (01310) was established by 20 times of passages through ECEs, acquiring high embryonic pathogenicity as well as high replication efficiency. The high pathogenicity resulted in early embryonic death and decrease of virus productivity because amount of harvested allantoic fluid were decreased. Because the PB2 gene of 01310 virus was prototypic and mammalian non-pathogenic, generation of complete recombinant virus containing 8 genomes of 01310 in 293T cells was impossible. The Hoffmanns vector system has fixed 3end promoter constellation that polymerase (PB1, PB2 and PA) genes have weak (Cytidine at fourth nucleotide, C4) but others have strong (Uridine, U4) promoters. To solve the difficulty of 01310 virus rescue, I changed the promoters of polymerases genes from C4 to U4 for compensation of weak activity of PB2 in 293T cells, and finally succeeded in virus rescue. Moreover, 01310 NS1/NEP gene was exchanged with a mammalian non-pathogenic NS1/NEP gene originated from an embryo non-pathogenic H9N2 virus (0028) to understand the role of NS1/NEP genes in embryo pathogenicity, and recombinant 01310 virus bearing 0028 NS1/NEP (r310-NS28) was generated. The r310-NS28 showed decreased embryo pathogenicity and increased productivity in terms of mean death time of embryo and total hemagglutinin unit, respectively. The introduction of mammalian pathogenicity-related mutations G139D/N, S151T, and GSEV to EPEV into 0028 NS1/NEP gene also increased embryo pathogenicity. Clade 2.3.4.4 H5Nx HPAIVs have spread world widely and clade 2.3.4.4a H5N8 virus was selected for emergency vaccine stockpiling program in Korea. However, the conventional PR8-derived recombinant H5N8 vaccine strain showed poor replication efficiency in ECEs and could replicate in the lungs of mice. To solve these problems, recombinant H5N8 viruses possessing several mutations (H103Y, K161E and L317P in HA, and S369N in NA) identified in previous study were generated to increase virus titer in ECEs. Only the H103Y increased virus titer significantly, but also increased mammalian pathogenicity. The increased mammalian pathogenicity was removed by replacing PR8 PB2 with 01310 PB2 genes without change in virus titer. Interestingly, H103Y introduction also increased heat-stability of hemagglutinin. The optimized recombinant H5N8 virus completely protect from challenge with clade 2.3.4.4 H5N6 HPAIV in chickens, and induced age-dependent humoral immunity in ducks. Furthermore, evolution pattern of H5 HPAIV derived by massive vaccination was analyzed to find strategy for future HPAIV vaccine strain development and vaccination program. It is well-known that continuous vaccination against HPAIVs facilitates appearance of antigenic variants. Clade 2.3.2.1c H5N1 HPAIVs have evolved from clade 2.3.2 H5N1 HPAIVs under vaccine-induced immune pressure, and amino acid sequences of HA proteins (n = 647) were compared to identify chronological variations. During the evolution clade 2.3.2.1c viruses acquired S144N and V223I mutations around the receptor binding site (RBS) of HA in order. The S144N mutation generated real N-linked glycosylation site (NGS) but it was less preferable NGS to 158N considering significantly higher frequency of 158NGS than 144NGS among HA proteins of H5 AIVs. The 144N and 158N are located in separate epitopes and their glycosylation may shield epitopes to result in humoral immunity evasion, and acquisition of 144NGS may be result of vaccination. The recombinant clade 2.3.2.1c H5N1 viruses having single reverse mutation (N144S or I223V) and combined reverse mutations (N144S and I223V) were generated and characterized. The recombinant virus with single reverse mutation had lower viral titer in ECEs and avian receptor binding affinity. However, both reverse mutations increased replication efficiency in ECEs and mammalian cells, and pathogenicity in mice. Interestingly, the I223V mutation dramatically decreased thermo-stability possibly by destabilizing heterotrimer interaction of HA proteins. Therefore, clade 2.3.2.1c H5N1 HPAIVs may have evolved to escape avian immunity in the cost of decreased viral fitness and mammalian pathogenicity. As results of the study, the innate defects and limits of Hoffmanns vector system affecting efficacy and pathogenicity of recombinant vaccine strains were improved by modification of 3-end promoter constellation and exchanging PR8 genes with less pathogenic avian-origin PB2 and NS1/NEP genes. The common functions of NS1 and H103Y in chicken and mammalian cells may reinforce the important role of chickens for evolution of mammalian pathogenicity of AIVs. The developed highly productive and mammalian non-pathogenic H9N2 and clade 2.3.4.4 H5N8 vaccine strains may be useful and contribute to produce more efficacious vaccines, and the experimental and bioinformatics data from clade 2.3.2.1c virus investigation also helpful to develop more efficacious vaccine strains in the future.