Development of stable n-caproate producing platform by shaping chain elongation microbiome and operating anaerobic membrane bioreactor

Abstract

카르복시산 플랫폼은 대량으로 생성되어 다양한 환경 문제를 야기하는 유기성 폐자원을 단순 저감이 아닌, 자원 회수의 측면에서 처리할 수 있는 높은 가능성을 가지고 있는 biorefinery 기술이다. 특히 플랫폼 케미칼 중 하나인 n-카프로익산은 소수성이 높아 고순도로 회수가 가능하기 때문에 많은 주목을 받고 있다. 그러나 폐기물 유래 n-카프로익산 생산 플랫폼은 기술적 타당성 측면에서 여전히 큰 한계가 있어, 실제 산업에 적용되기 위해서는 추가적인 연구가 반드시 필요한 상황이다. 이러한 한계의 가장 큰 원인은 폐기물의 복잡성을 처리하기 위해 사용되는 개방 배양 발효의 광범위한 유전자 풀과 다양한 대사활동을 제어하기 어렵다는 점이다. 따라서 본 논문에서는 n-카프로익산 생산 미생물 군집을 이해하고, 높은 생산성을 보이는 동시에 안정적인 운전이 가능한 시스템을 개발하는 것을 목표로 한다. 첫번째 장에서는 혐기성 소화 슬러지로부터 n-카프로익산을 생산하는 미생물군집을 형성하기 위한 최적의 환경 조건이 Design-Build-Test-Learn engineering framework을 통해 결정되었다. Design-Build-Test-Learn engineering framework의 첫번째 시행에서는 전자공여체의 종류가 L-락트산로 결정되었으며, 이때 헤드스페이스에 H2 가스를 주입하여 주는 것이 n-카프로익산의 선택성이 증가하는 효과를 가져올 수 있음을 확인하였다. 이어진 시행에서는 전자수용체를 결정하기 위한 실험을 수행하였고, n-부티르산이 주입된 경우에 가장 높은 효율을 보였다. 마지막 시행에서는 이산화탄소의 연속 제어가 n-카프로익산의 생산을 크게 증진시킬 수 있다는 것을 확인하였고, 이때 전자공여체와 전자수용체의 최적 농도를 결정할 수 있었다. 이러한 일련의 과정을 통해, n-카프로익산의 선택성을 19.8%에서 68.6%로 크게 증가시킬 수 있음이 확인되었고, n-카프로익산 생산균인 Clostridium carboxidivorans가 우점화 되었음을 확인하였다. 목표 미생물의 우점화 조건을 찾은 이후에는 해당 미생물이 반응조 내에 축적될 수 있는 공학 기술을 채택하여 적용하여 보았다. 우선 DBTL engineering framework을 통해 도출된 최적의 환경 조건 하에서 연속 회분식 반응기를 운전하였다. 그 결과, n-카프로익산이 모든 회분식 반응 운전 조건에서 57.3-62.6%의 n-카프로익산 선택성을 보이며 안정적으로 생산되었다. 또한 반복 횟수가 증가함에 따라, L-락트산 소모 및 n-카프로익산 생산속도가 증가하였고, 이는 실제 기능을 수행하는 미생물이 순응 과정을 거쳐 더 높은 반응성을 보일 수 있었기 때문인 것으로 예상된다. 실제로 5번째 반복 이후에 미생물 군집을 분석해본 결과, C. carboxidivorans의 상대 빈도가 38.4%까지 증가하였음을 확인할 수 있었다. 하지만 연속 회분식 반응기는 낮은 침강 속도로 인해, 장기적 운전에 적합하지 않은 기술로 판단되었고, 이어진 실험으로 연속 회분식 반응기의 운전 조건을 모사한 혐기성 막 반응기를 장기적으로 운전하였다. 장기 운전 결과 n-카프로익산 생산균인 Caproiciproducens galactitolivorans의 상대 빈도가 78.8까지 증가할 수 있었지만, L-락트산에 대한 경쟁 미생물인 프로피온산 발효균, Propionibacterium freundenreichii 또한 16.5%의 상대 빈도를 보여, n-카프로익산의 선택성이 35.2%로 감소하였다. 이어진 실험에서는 혐기성 반응조 생태계 내에서 미생물에 가해지는 선택 압력을 높여 프로피온산 발효균을 완전히 도태시키고자 하였고, 이를 위해 기질 주입 방식을 반연속식에서 연속식으로 바꾸었다. 그 결과, 반응조 배지 내 기질의 농도가 낮은 수준으로 유지되었고, 이에 따라 프로피온산 발효가 저해될 수 있음을 확인하였다. 특히 P. freundenreichii 의 상대 빈도는 2.3%로 감소되었고, 이에 따라 n-caproate의 선택성이 58.1%까지 향상될 수 있었다. 하지만 시간이 지남에 따라 홀수 탄소 수 카르복시산의 농도가 점차적으로 증가함이 확인되었고, 이를 완전히 배제하기 위해, 초기부터 연속식으로 기질을 주입하는 새로운 혐기성 막 반응조를 운전하였다. 25일의 작동 후, 유출수 내 프로피온산의 농도가 검출 한계 이하로 줄어듦이 확인되었고, n-카프로익산의 선택성이 70.5%까지 크게 향상되었다. 개발된 폐기물 유래 n-카프로익산 플랫폼을 평가하기 위해서 우유 가공 폐수를 원료로 사용하여 n-카프로익산 생산 실험을 수행하였다. 유당이 고농도로 함유된 우유 가공 폐수를 이용해 제작한 배지에 폐 액상 요거트를 접종하여 락트산 발효를 진행하였고, 4,543 mg_C/L의 락트산을 생산할 수 있었다. L-락트산의 농도가 50 mM에 도달하였을 때, 발효액을 샘플링하여 n-카프로익산 생산 반응의 배지로 사용하였다. 본 연구에서 확보한 n-카프로익산 생산 미생물군집을 락트산 발효액에 접종하였고, 38.4%의 전환 효율로 우유 가공 폐수로부터 n-카프로익산을 생산할 수 있었다.

The carboxylate platform is one of the most promising biorefinery technologies that has a high potential to recover carbon and energy from massively generated organic waste. In particular, the production of n-caproate is getting more attention because the product is a versatile platform chemical that can be recovered in high purity. However, the waste-to-n-caproate platform still has huge limitations in terms of technological feasibility, and further research is necessary to reach the industrial scale. This is because it is difficult to control the wide genetic pool and various metabolic activities of open-culture fermentation that is necessary to deal with the complexity of waste. In this regard, the objectives of the present work were to unveil the complicating nature of open-culture n-caproate-producing microbiome and make the system more productive and reliable. In the experiment described in Chapter 1, the optimum environmental conditions for shaping n-caproate-producing microbiome from anaerobic digestion sludge were determined using the Design-Build-Test-Learn (DBTL) engineering framework. In the first cycle of the DBTL engineering framework, the type of electron donor was determined to be L-lactate, and the H2 gas in the headspace was found to be beneficial for n-caproate production. In the subsequent cycle of the DBTL engineering framework, the type of electron acceptor was determined to be n-butyrate. Finally, in the last cycle, the concentrations of electron donor and acceptor were determined and continuous removal of headspace CO2 was applied. In conclusion, 50 mM of L-lactate and 10 mM of n-butyrate injection with initial H2 supply and continuous CO2 removal was determined as the optimum operation condition for shaping n-caproate-producing bacteria from anaerobic digestion sludge. As a result, the selectivity of n-caproate could be increased from 19.8% to 68.6%. In addition, the n-caproate-producing bacteria, Clostridium carboxidivorans, were enriched, and their relative abundance reached 24.5%. In the following chapter, we describe the engineering technologies adopted for accumulating n-caproate-producing bacteria in the reactor system. In the beginning, a sequential batch reactor (SBR) was operated under optimum environmental conditions derived from the DBTL engineering framework. As a result, n-caproate with stable performance (i.e., n-caproate specificity 57.3–62.6%) was actively produced during repeated batch operation. In addition, the production rate could be increased owing to the acclimation of the functional bacteria. The relative abundance of Clostridium carboxidivorans could be increased to 38.4% after the fifth cycle of the SBR operation. However, SBR was not applicable for long-term operation due to the slow settling velocity of the biomass. Therefore, a semi-continuous anaerobic membrane reactor (AnMBR) was operated to imitate the SBR system. However, the long-term operation of the semi-continuously fed AnMBR showed low n-caproate selectivity (i.e., 35.2%) because of the occurrence of a competitive reaction, that is, propionate fermentation. A microbiome composition analysis revealed that the microbiome was abundant with well-known n-caproate-producing bacteria, Caproiciproducens galactitolivorans (relative abundance 78.8%). However, the L-lactate-consuming propionate-producing bacteria, Propionibacterium freudenreichii (relative abundance 16.5%), were also enriched, and the conversion of L-lactate to n-caproate was severely reduced. To elevate the selection pressure and exclude the propionate-producing bacteria, a continuously fed AnMBR was operated. As a result, the selectivity of n-caproate increased to 58.1%, while that of odd-carbon-number carboxylates dropped to 7.7%. Furthermore, the relative abundance of P. freudenreichii decreased to 2.3% after 2 weeks of continuously fed AnMBR operation. Although the n-caproate selectivity doubled after changing the feeding regime, the odd-carbon-number carboxylates were still produced. Therefore, another continuously fed AnMBR was operated to completely exclude the production of odd-carbon-number carboxylates. After 25 days of the operating period, the propionate concentration in the effluent dropped below the detection limit (i.e., 0.1 mM), and the n-caproate selectivity reached 70.5%. In the last part of the thesis, the developed waste-to-n-caproate platform was evaluated using milk processing wastewater as a feedstock. This lactose-rich wastewater was fermented using waste liquid yogurt as an inoculum, resulting in the production of 4,543 mg_C/L of lactate. When the L-lactate concentration reached 50 mM, the fermentation broth was collected and supplied to the microbiome obtained from the continuously fed AnMBR as a media for chain elongation reaction. The waste-to-n-caproate platform developed in this study could convert the carbohydrates in the milk processing water to the target product (i.e., n-caproate) with a selectivity of 38.4% (calculated based on mg_C/L).