Genetic analysis of human coronavirus (SARS-CoV-2) and porcine coronavirus (PEDV) and their genetic mutations having potential to affect viral antigenicity and diagnosis

Abstract

바이러스는 면역 회피를 유발할 수 있는 유전적 돌연변이를 통해 숙주 면역과 계속해서 싸우고 있으며, 이러한 바이러스의 생존 전략은 앞으로도 계속 될 것이다. 특히, 유전자 변이에 따른 아미노산 서열의 비상동성 (non-synonymous) 변화는 바이러스 에피톱의 항원성을 변화시킬 수 있으며, 이러한 변화는 기존에 개발된 백신의 방어능을 저하시킬 수 있다. 또한, 바이러스의 염기서열의 변이는 현재 일상적으로 사용되는 진단 기술인 중합효소연쇄반응 (PCR)과 효소결합면역흡착분석법 (ELISA)의 진단 정확도를 저해 할 수 있다. 따라서 바이러스가 진화함에 따른 중요한 그들의 유전학적 변화를 조사하고 추적하는 것은 바이러스에 대한 적절한 예방 및 진단 전략을 수립하는 데 매우 큰 도움이 된다. 이 연구에서는 현재 사람과 돼지에서 심각한 문제가 되고 있는 코로나바이러스의 유전적 변이와 그 변이들이 바이러스의 항원성과 진단에 영향을 미칠 가능성에 대해 조사하였다. 첫 번째 장에서는 최근 사람에서 문제가 되고 있는 severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2 (SARS-CoV-2)를 분석하였다. 코로나바이러스의 스파이크 (S) 단백질은 바이러스의 세포 내 유입에 결정적인 역할을 하는 표면 단백질이다. 따라서, 이 연구에서는 항원성과 면역학적 특징을 확인하기 위해 SARS-CoV-2의 S 유전자를 분석하였다. S 유전자를 기반으로 한 계통학적 분석에서 SARS-CoV-2 분리주들 사이에 두 개의 유전자 그룹이 존재하는 것을 확인하였다. 이 두 개의 유전자 그룹은 하나의 특이적인 염기서열 변이인 D614G에 의해 나뉘었다. 이 변이는 SARS-CoV-2가 숙주의 면역체계를 회피하는데 결정적인 역할을 할 것으로 생각되었다. D614G 염기서열 변이를 포함하는 S1 domain의 에피톱 부위에 대해 항원 지수 분석을 시행한 결과, SARS-CoV-2b 유전자 그룹이 SARS-CoV-2a 유전자 그룹에 비해 유의적으로 감소한 항원 지수를 보이는 것으로 확인하였다. 따라서, 이 유전적 변이에 의해 두 유전자 그룹간의 항원성 차이가 발생하였을 것으로 생각되었다. 두 유전자 그룹간 항원성 차이가 발생하였다면 두 유전자 그룹을 백신에 포함시키는 것이 COVID-19을 방어하는데 보다 효율적일 것이다. 그러므로, 실제로 두 유전자 그룹간 항원성 차이가 발생하였는지 확인하는 것이 시급하다. 두 번째 장에서는 전 세계 돼지 산업에 지속적이고 심각한 피해를 입히고 있는 돼지유행성설사바이러스 (PEDV)를 분석하였다. 최근 양돈장의 PEDV 유병률은 약 9.92 %로 지속적으로 문제가 되고 있음이 확인되었다. 뉴클레오캡시드 (N) 유전자를 기반으로 베이지안 계통 분석을 진행한 결과, 세 개의 주요 N 유전자 기반 유전자 그룹 (N1, N2 및 N3)과 두 개의 하위 유전자 그룹 (N3a과 N3b) 을 확인하였다. N 단백질에 포함된 에피톱 부분의 항원 지수를 분석한 결과, 유전자 그룹간 항원성에 차이가 있을 것으로 강하게 의심되었다. 에피톱 부위에서 N3 유전자 그룹의 항원 지수는 N1 및 N2 유전자 그룹의 항원 지수에 비해 유의하게 낮았다. 이러한 변화는 N1 단백질을 항원으로 사용하는 ELISA 키트의 진단 결과에 영향을 미칠 것으로 판단되었다. 또한, 최근 확인된 한국 PED 바이러스들의 S 유전자를 분석한 결과, 스파이크 단백질 (COE, S1D 및 2C10)의 B 세포 에피토프 서열의 일부에서 유의적으로 낮은 항원 지수가 확인되었다. 이러한 S 및 N 유전자의 면역학적 주요 부위에 유전적 변이가 발생한 PED 바이러스들은 기존에 확립된 숙주 면역을 회피하여 돼지 농장에 심각한 손상을 줄 수 있기 때문에 지속적인 감시가 필요하다. 이 연구에서 바이러스의 면역 회피나 진단 오류를 유발할 수 있는 중요한 유전적 변이를 현재 심각한 문제가 되고 있는 사람과 돼지 코로나바이러스에서 확인하였다. 이러한 발견은 바이러스 감염 예방에 대한 더 나은 이해와 보다 정확한 진단법을 개발하는데 도움을 줄 것으로 기대한다. 나아가 향후 코로나바이러스 진화에 적절히 대응할 수 있도록 유전자 분석을 통한 지속적인 감시가 유지되어야 한다.

Aspect of virus evolution, viruses have continued to fight with host immune through genetic mutation facilitating immune evasion and this strategy of viruses for their survival will continue in the future. Genetic mutation, which may change structural form of viral proteins by non-synonymous changes, may alter antigenicity of a viral epitope and in turn can lead to decreased efficacy of previously developed vaccine for the virus. Furthermore, such genetic mutation can hamper diagnostic accuracy of polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which are routinely used diagnostic techniques. Thus, it is very important work to investigate and track critical genetic events along with virus evolution. These efforts can give worthy information and insight to establish appropriate prevent and diagnostic strategy for viruses. Herein, human and animal coronaviruses causing sever disease were investigated by genetic and phylogenetic analysis. As stated in chapter I, The S glycoprotein of coronaviruses is important for viral entry and pathogenesis with most variable sequences. Therefore, we analyzed the S gene sequences of SARS-CoV-2 to better understand the antigenicity and immunogenicity of this virus in this study. In phylogenetic analysis, two subtypes (SARS-CoV-2a and -b) were confirmed within SARS-CoV-2 strains. These two subtypes were divided by a novel non-synonymous mutation of D614G. This may play a crucial role in the evolution of SARS-CoV-2 to evade the host immune system. The region containing this mutation point was confirmed as a B-cell epitope located in the S1 domain, and SARS-CoV-2b strains exhibited severe reduced antigenic indexes compared to SARS-CoV-2a in this area. This may allow these two subtypes to have different antigenicity. If the two subtypes have different serological characteristics, a vaccine for both subtypes will be more effective to prevent COVID-19. Thus, further study is urgently required to confirm the antigenicity of these two subtypes. As stated in chapter I, Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) causes continuous, significant damage to the swine industry worldwide. By RT-PCR-based methods, this study demonstrated the ongoing presence of PEDV in pigs of all ages in Korea at the average detection rate of 9.92%. By the application of Bayesian phylogenetic analysis, it was found that the nucleocapsid (N) gene of PEDV could evolve at similar rates to the spike (S) gene at the order of 10−4 substitutions/site/year. Based on branching patterns of PEDV strains, three main N gene-based genogroups (N1, N2, and N3) and two sub-genogroups (N3a, N3b) were proposed in this study. By analyzing the antigenic index, possible antigenic differences also emerged in both the spike and nucleocapsid proteins between the three genogroups. The antigenic indexes of genogroup N3 strains were significantly lower compared with those of genogroups N1 and N2 strains in the B-cell epitope of the nucleocapsid protein. Indeed, there is different antigenicity between the genogroups based on the N gene, it may affect diagnostic results using commercial ELISA kits based on N1 protein. Similarly, significantly lower antigenic indexes in some parts of the B-cell epitope sequences of the spike protein (COE, S1D, and 2C10) were also identified. PEDV mutants derived from genetic mutations of the S and N genes may cause severe damage to swine farms by evading established host immunities. In conclusion, the crucial genetic variations, which may induce immune evasion or diagnostic error, were revealed in these coronavirus. It is expected that these results provide better understanding for preventing viral infection and more precise diagnosis. Also, constant surveillances through genetic analysis should maintain to appropriately respond to coronavirus evolution in the future.