Therapeutic effect and safety of human serum albumin-CDDP complex in U87MG subcutaneous xenograft tumor models

Abstract

서론: 시스플라틴(CDDP)은 많은 고형암 치료에 사용되는 항암제중의 하나이다. 시스플라틴이 혈청 단백질 중 가장 많은 부분을 차지하는 사람 혈청 알부민 (HSA)에 결합한다는 것이 기존 약동학연구를 통해 밝혀졌다. 사람 혈청 알부민은 수동 표적 기전과 SPARC (Secreted protein acidic and rich in cysteine) 단백질에 의한 능동 표적 기전에 의해 종양에 축적될 수 있다는 나노 전달체로서의 장점을 가진다. 신경교종은 SPARC 단백질을 과발현 하는 암종으로, CDDP를 신경교종의 치료에 사용함에 있어서 시스플라틴의 전달률이 낮다는 문제점이 있어왔다. 본 연구에서는 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체(HSA-CDDP)의 SPARC 매개를 통한 항암 치료제로서의 가능성을 확인하고자 하였다. 방법: 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체의 알부민 의존적인 치료 효과를 확인하기 위해, SPARC발현을 서로 달리하는 두 종류의 U87MG 세포주를 사용하여 전체적인 실험을 진행하였다 (U87MG: SPARC 발현이 높은 세포주, U87MG-shSPARC: SPARC 발현이 낮은 세포주). 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체의 세포 내 섭취가 SPARC 의존적으로 일어나는지를 확인하기 위해 공초점 현미경을 이용하여 세포 섭취를 관찰하였다. 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체의 세포독성은 시스플라틴과 비교하여 cell counting kit-8을 이용하여 확인하였으며, 세포 사멸은 FACS를 통해 관찰하였다. 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체의 생체 내 항암효과는 마우스의 종양 이종이식 모델을 이용하여 확인하였다. 종양의 크기가 50mm3에 도달하였을 때, 시스플라틴 또는 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체를 마우스에 정맥을 통해 2일에 한 번씩, 총 7회 투여하여 주었다. 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체의 생체 내 분포는 동위원소인 [177Lu]을 표지하여 준 후 단일 광자 단층촬영 기법 (SPECT)을 이용하여 영상화 하여 확인하였으며, 실제 생체 장기 내 시스플라틴 양의 측정을 통해서도 확인하였다. 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체의 생체 내 독성 효과를 확인하기 위해 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체를 투여한 마우스의 혈액에서 간, 신장 기능을 나타내는 혈액 내 표지자들을 확인하였으며, 조직을 헤마톡실린 & 에오신 (H&E) 염색과 TUNEL 분석법을 이용하여 확인하였다. 결과: SPARC를 발현하는 세포주에서 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체가 높게 섭취되는 것을 확인하였으며, SPARC발현이 낮은 세포주의 경우에도 외부적으로 SPARC 단백질을 처리해주는 경우 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체의 섭취가 증가되는 것을 확인하였다. 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체의 세포 독성이 SPARC 발현 세포주에서 높게 나타나는 것을 확인하였다. SPARC 단백질이 발현되는 종양의 경우 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체를 처리해준 경우에 시스플라틴을 처리해준 경우와 비슷한 정도의 종양 성장정도와 마우스의 생존율을 확인할 수 있었으며, 시스플라틴을 처리해준 경우에 나타나던 마우스의 체중 감소는 관찰되지 않았다. 생체안전성 확인에서는 혈액 마커 확인과 병리조직학 관찰을 통해 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체가 시스플라틴에 비해 신장독성이 낮은 것을 확인할 수 있었다. 결론: 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체는 SPARC의존적인 알부민에 의한 종양 내 축적을 보였다. 치료 효과 측면에서 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체는 시스플라틴과 비슷한 정도의 치료 효과를 보였으며, 시스플라틴의 가장 큰 문제인 신장독성이 감소된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해, 본 연구에서는 사람 혈청 알부민-시스플라틴 결합체의 치료효과는 SPARC 의존적인 알부민에 의한 것이었음을 확인하였으며, 시스플라틴에 비해 신장독성은 감소시키며 치료효과는 시스플라틴과 비슷하게 나타나는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 알부민 결합 수용체를 과발현 하는 신경교종에의 약물 전달체로 이용가능한 알부민의 치료제로서의 가능성을 보여주었다고 할 수 있다.

Introduction: Cisplatin (cis-diamminedichloroplatinum (II), CDDP) is a chemotherapeutic drug widely used against many solid tumors. A pharmacokinetics study found that CDDP can bind to human serum albumin (HSA), which is the most abundant plasma protein in serum. HSA has the advantage of being a nanocarrier and can accumulate in tumors by passive targeting and active targeting mediated by the secreted protein acidic and rich in cysteine (SPARC). Glioma is one of the cancers which highly express SPARC protein. Using CDDP for therapeutic agent against glioma have some limitation, because of the limited delivery of CDDP in glioma tumor. In this study, we investigated the possibility of using a CDDP conjugated HSA complex (HSA-CDDP) as a SPARC-mediated therapeutic agent. Materials and Methods: To investigate the HSA-dependent therapeutic effect of HSA-CDDP, we used two types of U87MG glioma cells that express SPARC differently (U87MG, which highly express SPARC protein; and U87MG-shSPARC, which exhibit low expression of SPARC protein). We observed the cellular uptake of HSA-CDDP as SPARC dependent manners using confocal microscopy. Cytotoxic effect of HSA-CDDP was also examined in two cells, compared with CDDP using cell counting kit-8 (CCK-8) and apoptosis analysis using FACS system. Antitumor effect of HSA-CDDP was examined using U87MG and U87MG-shSPARC subcutaneous xenograft tumor model in mice. When tumor volume reached 50mm3, CDDP and HSA-CDDP was injected into mice by intravenous injection every other day, to a total of seven times (3 mg/kg CDDP and same amount of CDDP from HSA-CDDP). Biodistribution of HSA-CDDP was also examined using [177Lu] labeled HSA-CDDP and CDDP measurement. To assess the toxicity of HSA-CDDP in mice, we monitored the blood marker of liver, kidney function and tissue section was stained with hematoxylin-eosin (H&E) and terminal deoxynucleotidyl transferase (TUNEL) assay. Results: HSA-CDDP was highly taken up in SPARC expressing cells and this uptake was enhanced with exogenous SPARC treatment in cells with low expression of SPARC. The cytotoxicity of HSA-CDDP was also higher in SPARC-expressing cells. In tumor models, HSA-CDDP showed a similar tumor growth and survival rate to CDDP only in SPARC-expressing tumor models, without showing weight loss which was observed in CDDP treated group. The biosafety test indicated that HSA-CDDP was less nephrotoxic than CDDP, based on blood markers and histopathology examination. Conclusion: HSA-CDDP exhibited SPARC-dependent HSA-mediated tumor accumulation in a U87MG subcutaneous xenograft mouse model. The therapeutic effect of HSA-CDDP was similar to that of CDDP, and nephrotoxicity, the major dose-limiting effect of CDDP, was reduced. From these results, we conclude that the therapeutic effect of HSA-CDDP was SPARC-dependent and HSA-mediated, and the therapeutic effect was similar to CDDP, while the nephrotoxicity associated with CDDP was reduced. We showed the feasibility of drug-carrying HSA as a therapeutic agent against glioma, which is a highly expressed albumin binding receptor.