CXCR4-MLNR 이형중합체의 신호전달에 대한 연구

Abstract

C-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR4)는 23종 이상의 암세포에서 발현되는 G protein-coupled receptor (GPCR)로 암의 진행 및 전이에 관여한다. 이에 따라 CXCR4를 조절하기 위해 다양한 기초, 중개, 임상적인 시도들이 있었다. 하지만 CXCR4는 정상적인 생명활동에서도 중요한 역할을 수행하기 때문에 이를 직접적으로 저해하는 것은 여러 부작용에 대한 위험을 가지고 있다. 이에 따라 본 연구에서는 GPCR 이형중합체라는 개념을 통해 CXCR4를 조절할 수 있는 GPCR을 찾고자 하였다. 먼저, 선행 연구에서 200개 이상의 GPCR을 이용한 Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) screening을 진행하여 41개의 CXCR4의 파트너 후보군을 확보하였다. 또한 이를 바탕으로 진행한 Ca2+ screening에서 CXCR4와 MLNR이 동시에 활성화됐을 때 세포 내 Ca2+ level이 시너지 효과를 보이며 증가함을 확인하였다. 본 연구에서는 두 GPCR의 이형중합체를 BiFC assay와 Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assay를 통해 규명하고, 두 GPCR이 동시에 활성화됐을 때 Ca2+ 신호전달과 β-arrestin2 의존적인 신호전달 및 생리적 기능을 탐구하였다. CXCR4-MLNR 이형중합체에서 하나의 GPCR이 활성화됐을 때보다 두 GPCR이 동시에 활성화됐을 때 세포 내 Ca2+ level과 CXCR4로의 β-arrestin2 recruitment가 시너지 효과를 보이며 증가했다. 이때 CXCR4로 β-arrestin2 recruitment가 증가함에 따라 CXCR4 internalization이 촉진되었다. 또한 MAPK scaffold로서의 기능이 알려진 β-arrestin2에 의해 ERK의 인산화가 증가하였다. 한편 하나의 GPCR이 활성화됐을 때보다 두 GPCR이 동시에 활성화됐을 때 혈액 암세포인 THP-1의 이동 (migration)이 유의미하게 증가하였다. 결론적으로, 본 연구 내용은 암세포의 생존 전략으로 GPCR 이형중합체를 이용할 가능성을 시사한다. 이러한 포괄적인 이해를 바탕으로 단일 GPCR로는 설명하는 데 한계가 있었던 GPCR의 복잡한 기능에 대한 이해를 높이고, 암세포의 특징적인 기능을 조절할 수 있는 신약 개발의 표적 범위를 확장할 뿐만 아니라 부작용을 줄이는 효과적인 신약 개발에 기여할 수 있다.

C-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR4) is expressed in more than 23 cancer cell lines and is highly implicated in progression or metastasis of cancer. Accordingly, there have been various basic, intermediary, and clinical trials to regulate CXCR4. However, CXCR4 also plays crucial roles in a variety of normal biological processes. Within this context, there have been concerns about unexpected side effects by directly inhibiting CXCR4. Therefore, we investigated GPCRs capable of regulating CXCR4 using the concept of a GPCR heteromerization. In the previous study, Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) screening was performed with more than 200 types of GPCRs to select 41 potential interactors of CXCR4. In accordance with this result, coactivation of CXCR4 and MLNR synergistically increased intracellular Ca2+ level. In this study, we demonstrated heteromerization between CXCR4 and MLNR using BiFC assay and Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assay. Additionally, we investigated Ca2+ signaling, β-arrestin2 mediated signaling and its physiological functions with coactivation of CXCR4 and MLNR. Coactivation of CXCR4 and MLNR showed synergistic increase in intracellular Ca2+ level and β-arrestin2 recruitment to CXCR4, compared to the sole activation of CXCR4 or MLNR, respectively. CXCR4 internalization was promoted with β-arrestin2 recruitment to CXCR4. Also, β-arrestin2, which is known to function as a MAPK scaffold, increased ERK phosphorylation. Furthermore, as CXCR4 and MLNR were coactivated at the same time, the migration of the blood cancer cells, THP-1, was significantly augmented. Consequently, this research suggests the possibility that cancer can exploit GPCR heteromerization as a survival strategy. Therefore, comprehensive understanding of GPCR heteromerization can contribute to expand target range of novel drug candidates that could potentially modulate the proliferative effects of cancer with reduced side effects.