Quantitative mapping of N-terminome and subcellular localized proteome

Abstract

Proteins are one of the fundamental molecules of the living organisms that play a variety of biological roles to maintain life. Many endogenous cellular proteins are tightly regulated from their expression to decay. Following the development of high-throughput proteomic analysis such as liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), it has become an essential tool for the systematic analysis of protein molecules with the unprecedented scale, time and depth. This thesis concerns methodological advances in both aspects of protein regulation and localization. First development of a novel method to examine global status of proteolytic events was carried through a new multiplexed N-terminomics method involving selective isobaric labeling of protein N-termini and immunoaffinity capture of the labeled N-terminal peptides. This method allows for not only identification of proteolytic cleavage sites, but also highly multiplexed quantification of proteolytic processing. I profiled a number of potential cleavage sites by signal peptidase and provided experimental confirmation of predicted cleavage sites of signal peptide. Furthermore, the present method uniquely represents the landscape of proteomic proteolytic processing rate during early embryogenesis in Drosophila melanogaster, revealing the underlying mechanism of stringent decay regulation of zygotically expressed proteins during early stages of embryogenesis. The second part of this thesis describes the development and application of the Massive Identification of Biotinylation Sites (MIBS) method, a newly developed method to identify biotinylation sites at the single amino acid level following intracellular proximity labeling. MIBS was applied to profile the localized proteome of mitochondria associated membrane (MAM) and endoplasmic reticulum. Based on the profiling results, the subcellular and suborganellar localization of identified proteins were systematically defined, as well as systematic topological mapping of transmembrane proteins. High-throughput proteomics approach by LC-MS can offer an unbiased landscape of proteomes and lead to unexpected findings. In this thesis, I introduced two types of newly developed methodologies that can carry not only global investigation of proteolytically processed sites and subcellular localized proteomes but also quantification of identified proteins of interest. By applying these methods, I discovered several phenomena of proteolytic events and precisely defined subcellular localized proteomes. Further development and improvement of mass spectrometry-based experiment methodologies will offer unique opportunities to discover unexpected proteomic regulations.

단백질은 다양한 생물학적 역할을 담당하며 살아있는 유기체의 생명 유지를 위해 매우 중요하다. 세포 내 대다수 단백질들은 발현에서 분해되기까지 매우 엄격한 조절기작에 의해 관리된다. 액체크로마토그래피/질량분석기에 기반한 단백체학 연구방법론은 최근의 눈부신 기술 개발에 힘입어 대규모의 시료를 보다 짧은 시간에 체계적으로 분석할 수 있게 되었으며, 단백체학 연구에 필수적인 기술이 되었다.

이 논문은 단백체의 분해 다이나믹스 및 아세포기관 단백체의 분포위치 매핑이라는 두 방향의 단백체학 방법론 개발에 관한 연구를 담고 있다. 전반부는 단백질 분해 중간체의 동적인 변화를 매핑할 수 있는 새로운 질량분석법을 기술하는데, 단백질의 N-말단에 다중정량분석이 가능하도록 화학적 표지물질을 유도화한 후, 표지된 N-말단 펩티드를 별도로 분리하여 질량분석함으로써 단백질 절단부위의 식별뿐 아니라 단백질 분해 중간체의 정량화를 가능하게 하였다. 그에 따라 여러 단백질의 신호펩티다아제에 의해 절단된 부위를 실험적으로 확인함과 동시에 알려져 있지 않던 새로운 신호절단부위를 예측하고 제시하였다. 또한 초파리 배아의 초기 발생 동안의 단백질 분해 중간체를 확인하고 정량화 함으로 써 단밸질체의 처리 속도를 측정하였고, 배아 발생 극초기 단계에서 배아의 유전체로부터 발현되는 단백질들이 아주 빠르게 분해 되다는 사실을 발견하였다.

후반부에서는 세포 내 근접표지방법에 의해 비오티닐화된 아미노산 잔기를 고도의 정확성과 획기적으로 향상된 효율로 동정할 수 있는 MIBS (Massive Identification of Biotinylation Sites) 분석법의 개발 및 적용에 대한 내용을 기술하였다. MIBS 분석법을 적용하여 미토콘드리아 연관의 막단백질 (MAM) 및 소포체의 단백체를 고해상도로 매핑할 수 있었다. 매핑 결과를 기반으로 식별된 단백질의 세포 내 위치 및 막단백질의 배향을 아세포 수준에서 체계적으로 결정하였다.

이 논문에서는 단백질 분해 처리 부위와 세포 내 위치에 대한 전반적 조사뿐만 아니라 확인된 단백질의 정량화를 수행할 수 있는 두 가지 유형의 새로운 방법론을 제시했다. 질량 분석법 기반 실험 방법론의 추가 개발 및 개선을 통해 기존에 알려지지 않은 단백질체의 성질 및 조절 원리를 발견할 기회가 더욱 늘어날 것으로 보인다.