Whole-slide image analysis reveals quantitative landscape of tumor-immune microenvironment in colorectal cancers

Abstract

Purpose: Despite the well-known prognostic value of the tumor–immune microenvironment (TIME) in colorectal cancers (CRCs), objective and readily applicable methods for quantifying tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) and the tumor–stroma ratio (TSR) are not yet available.

Experimental Design: We established an open-source software based analytic pipeline for quantifying TILs and the TSR from whole-slide images obtained after CD3 and CD8 immunohistochemical staining. Using random forest classifiers, the method separately quantified intraepithelial TILs (iTIL) and stromal TILs (sTIL). We applied this method to discovery and validation cohorts of 578 and 283 stage III or high-risk stage II CRC patients, respectively, who were subjected to curative surgical resection and oxlaliplatin-based adjuvant chemotherapy.

Results: Automatic quantification of iTILs and sTILs showed a moderate concordance with that obtained after visual inspection by pathologists. The K-means–based consensus clustering of 197 TIME parameters that showed robustness against variations in tumor area annotation caused CRCs to be grouped into five distinctive subgroups, reminiscent of those for consensus molecular subtypes (CMS1-4 and mixed/intermediate group). In accordance with the original CMS report, the CMS4-like subgroup (cluster 4) was significantly associated with a worse 5-year relapse-free survival and proved to be an independent prognostic factor. The clinicopathologic and prognostic features of the TIME subgroups were reproduced in an independent validation cohort.

Conclusions: Machine-learning–based analysis of whole-slide histopathologic images can be useful for extracting quantitative information about the TIME. This information can classify CRCs into clinicopathologically relevant subgroups without performing molecular analyses of the tumors.

종양면역미세환경(Tumor-immune microenvironment)이 대장암에서 중요한 예후인자라는 사실은 이전부터 잘 알려져 있었지만, 종양침윤림프구(Tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)와 종양 내 기질 분율 (tumor-stroma ratio, TSR)에 대한 객관적이고도 간단한 측정법은 지금까지 발표된 바 없었다. 이에 우리는 종양 조직에 대한 CD3, CD8 면역조직화학염색 슬라이드의 전체 이미지로부터 TIL과 TSR을 정량할 수 있는 공개소프트웨어 기반의 분석 파이프라인을 구축하였다. 대표적 기계학습 기법인 랜덤포레스트 (Random forest)를 이용하여 주어진 이미지 상에서 종양과 기질을 구분할 수 있도록 하였고, 한 환자 당 TIL과 TSR에 대한 208종의 파라미터를 산출하였다. 이 분석기법을 서울대학교병원에서 2005년부터 2012년 사이에 대장암 수술을 받고 2기 고위험군 또는 3기로 진단되어 옥살리플라틴(oxaliplatin) 기반의 항암치료를 받은 578명의 환자군에 적용하였고, 208종의 파라미터 중 반복 분석에도 값이 심하게 흔들리지 않는 197종의 파라미터에 대한 군집분석 (Clustering analysis)을 시행하여 578명의 환자들을 다섯 아형으로 분류하였다. 그 결과 각 아형들의 임상병리학적 특성이 대장암의 분자적 아형으로 기존에 정립되어 있는 consensus molecular subtype (CMS)의 각 아형들의 그것과 1:1 대응 관계를 보인다는 사실을 발견하였다. CMS 아형 중에서는 조직 내 섬유화 정도가 심한 네번째 아형이 가장 나쁜 예후를 보이는 것으로 알려져 있었는데, 본 연구결과에서도 조직 내 섬유화 정도가 심한 아형이 나쁜 5년 무재발 생존율 (relapse-free survival)과 유의미한 상관관계를 보였고 이것이 TNM 병기 및 종양 분화도에 대한 보정 후에도 독립적 예후예측인자로 작용함을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 임상병리학적 특성 및 예후적 특성이 분당서울대학교병원에서 2007년부터 2012년 사이에 모집된 283명의 독립적 환자군에서도 재현됨을 확인할 수 있었다. 이는 기계학습 기반의 조직 병리 이미지 분석이 종양면역미세환경에 대한 정량적 정보를 얻기 위한 유용한 방식임을 확인한 것이며, 이러한 정량적 정보를 이용하면 분자생물학적 실험을 수행하지 않고도 대장암 환자들을 임상적으로 유의미한 아형으로 분류할 수 있음을 입증한 것이라 할 수 있다.