DNA 메틸화 분석을 통한 분비나무(Abies nephrolepis) 배발생 관련 유전자 탐색

Abstract

Abies nephrolepis Maxim. is an evergreen coniferous tree that inhabits subalpine zone in Korea, and needs in vitro research, in situ and ex situ conservation due to extremely decreased habitat and population. Somatic embryo is an embryo that obtained from somatic cells asexual reproduction through dedifferentiation and redifferentiation. Somatic embryogenesis has advantages as morphological and molecular studies of embryogenesis as well as mass propagation. Previous studies of somatic embryogenesis usually conducted for finding suitable condition of embryogenic callus and somatic embryo induction, and mechanism of embryogenic-competence acquisition is unclear. DNA methylation is one of several epigenetic mechanisms that can repress or activate expression of genes without changing the sequence. This study aims to induce embryogenic callus and somatic embryo of Abies nephrolepis, and compare DNA methylation state of embryogenic and non-embryogenic callus that share same DNA. For the study, cones were collected at the multi-function seed orchard of Abies nephrolepis located in Hwaseong, Gyeonggi-do. Seeds were then extracted at 6 different maturity stages from May to July in 2020, and zygotic embryos were inoculated to embryogenic callus induction medium. Induced embryogenic calli were continuously subcultured, and non-induced ones were subcultured to 5-azacytidine treated medium. The seeds collected on June 5th(stage 2) showed highest induction rate(12%), and seeds collected at stages 5 and 6 were not induced. After treatment of 5-azacytidine, a few of the 5th and the 6th stage zygotic embryos induced embryogenic callus. In order to analyze, 5 sets with 10 samples were selected. Each set consisted of embryogenic callus and non-embryogenic callus that derived from the same explant, so shared same DNA. After DNA extraction, MSAP-seq was used to analyze differentially methylated site. Through data preprocessing, K-mer comparison and DMS designation, embryogenesis related genes were annotated by BLASTn in DMS. As a result of analysis, average 23% of five sets embryogenic and non-embryogenic callus shared hypomethylated CG methylation region, and remaining 77% showed differentially methylated status. Stress, cell division and structure, transcription, and kinase related genes were annotated as embryogenesis-related gene. The result showed significant differences between embryogenic callus and non-embryogenic callus in terms of CG methylation, but annotated genes function didnt show meaningful tendency between EC DMS and NEC DMS except transcription related genes. In fact, there was no available Abies nephrolepis reference genome, so only 2.3% of DMS was annotated and analysis of promoter region was impossible. Also, gene body methylation of embryogenesis-related genes should be supplemented with expression analysis. In this study, transition from non-embryogenic callus to embryogenic callus was observed by the treatment of DNA methylation inhibitor 5-azacytidine, and DNA methylation differences of calli which shared same DNA but differed in embryogenic competence were analyzed, indicating that acquisition of embryogenic competence and DNA methylation are interrelated. Based on DMS sequences screened in this study, multi-omics approach and research of correlation between noncoding sequence methylation and embryogenic competence will all enhance understanding of plant regeneration mechanisms through further studies.

분비나무(Abies nephrolepis Maxim.)는 우리나라 해발 700m 이상의 지역에서 생육하는 아고산대 침엽수종으로, 기후변화에 따른 서식지 감소로 인해 현지내∙외 보전 및 기내 연구가 필요하다. 체세포배는 무성생식을 통해 체세포에서 캘러스로의 탈분화, 체세포배로의 재분화 과정을 거쳐 발생되는 배이다. 체세포배 발생은 대량 증식 수단으로의 장점을 가지며, 접합자배와 발달 단계에서 많은 부분을 공유하기 때문에 배발생의 형태학적, 분자생물학적 연구 재료로의 가치가 있다. 배발생 캘러스와 체세포배 유도 조건에 대한 연구는 활발히 이루어져 왔지만, 체세포에서 배발생 캘러스로의 전환을 통한 배발생능 획득 기작 연구는 미비하다. DNA 메틸화는 후성유전학적 기작으로 기존의 유전학이 DNA 염기서열 차이를 기반으로 하는 것에 비해 같은 염기서열을 가지는 DNA의 구조적 변형에 따른 유전자 발현 조절에 대해 연구한다. 본 연구는 분비나무에서 배발생 캘러스 및 체세포배를 유도하고, 동일한 DNA를 가지는 분비나무 배발생 캘러스와 비배발생 캘러스의 DNA 메틸화를 비교하고자 하였다. 경기도 화성시에 위치한 분비나무 다목적 채종원에서 2020년 5월 말부터 7월 초까지 여섯 시기로 나누어 구과를 채취, 탈종 후 종자에서 접합자배를 분리하여 배발생 캘러스를 유도하였다. 유도된 배발생 캘러스는 증식 배지로 계대배양하고, 유도되지 않은 개체들에 대해서는 DNA 메틸화 저해제 5-azacytidine이 처리된 배지로 계대배양 하였다. 6월 5일(2단계) 채취 종자에서 가장 높은 12%의 배발생 캘러스 유도율이 확인되었고, 5단계 및 6단계 채취 종자에서는 배발생 캘러스가 유도되지 않았다. 5 및 6단계 접합자배에 5-azacytidine 처리한 후 일부 개체에서 배발생 캘러스가 유도되었다. 같은 시료에서 발생하여 동일한 DNA를 가지는 배발생 캘러스와 비배발생 캘러스를 한 세트로 총 다섯 세트, 10개의 샘플을 분석 대상으로 선정하였다. DNA 추출 후 DNA 메틸화에 특이적인 제한효소를 이용한 MSAP를 기반으로 NGS Illumina 플랫폼을 이용하여 메틸화 차이 부위를 시퀀싱(MSAP-seq)하였다. 시퀀싱 데이터 전처리, K-mer 비교, DMS 지정 과정을 거쳐 서로 다르게 메틸화된 부위(DMS; differentially methylated site)에 위치한 유전자를 BLASTn을 통해 annotation 한 후 이를 배발생 관련 유전자로 분석하였다. 분석 결과 다섯 세트의 배발생 캘러스와 비배발생 캘러스에서 평균 23%의 CG 탈메틸화 부위를 공유하며, 나머지 77% 부위는 메틸화에 차이를 보이는 것으로 나타났다. 스트레스, 세포 분열 및 세포 구조, 전사 조절, 키나아제 관련 유전자들이 배발생 관련 유전자로 확인되었다. CG 메틸화에 있어서 비배발생 캘러스와 비배발생 캘러스의 차이를 확인하였지만, annotation된 유전자의 기능 면에서 배발생 캘러스와 비배발생 캘러스 각각에서 전사 조절 관련 유전자를 제외하고는 유의미한 경향성을 보이지 않았다. 이에 대해 분비나무 표준 유전체의 부재로 DMS의 2.3%만이 annotation되었으며 프로모터 부위에 대한 분석이 불가능하였음을 고려할 수 있다. 또한 배발생 관련 유전자의 유전자체 메틸화(gbM)와 관련하여 추가 발현 연구의 필요성이 있다고 판단된다. 본 연구를 통해 배발생 캘러스가 발생하지 않았던 개체에서 메틸화 저해제 처리를 통해 일부 배발생 캘러스로의 전환을 관찰하고, 같은 DNA를 가지지만 배발생능이 다른 캘러스들의 DNA 메틸화 차이를 분석함으로써 배발생능 획득과 DNA 메틸화가 서로 연관되어 있음을 알 수 있었다. 향후 본 연구에서 스크리닝한 DMS 염기서열을 기반으로 비암호화 서열(noncoding sequence) 메틸화와 배발생능의 연결, 그리고 후성유전체와 더불어 유전체, 전사체의 다중 오믹스(multi-omics) 연구 등을 통해 식물 재분화 기작에 대한 이해를 보다 높일 수 있을 것으로 기대한다.