Inactivation of foodborne pathogens using Sargent juniper-inspired sesquiterpenoid as synergistic phytochemicals

Abstract

항생제 내성 균주의 출현으로 현재 다양한 식중독 유발 균주에 즉각적으로 대응할 수 있는 새로운 항생제의 개발이 절실해지고 있다. 이에 대한 대응책의 일환으로, 최근 식물 정유에서 유래된 파이토케미컬이 천연 항미생물제로 주목받고 있다. 정유 그 자체로도 뛰어난 항미생물 활성을 보이는 것으로 밝혀졌으나, 정유 내 파이토케미컬의 구성 성분과 이들 간의 상호작용에 대한 연구는 미미한 실정이다. 따라서, 식물 유래 파이토케미컬 중 특히 단리가 어려운 세스퀴터페노이드의 경우 항미생물 활성과 상호작용에 대한 연구가 지속적으로 요구되어 왔다. 본 연구에서는 식물 유래 세스퀴터페노이드의 활성을 박막 크로마토그래피-생리활성 평가법(TLC-DB)과 분취용 박막 크로마토그래피(prep. TLC)를 통해 다각도로 구명하고자 한다. 대상 정유는 고도에 따라 채취한 국내의 눈향나무 2종의 잎에서 추출하였다. 디스크 확산법을 통해 그람양성균과 그람음성균에 대한 두 눈향나무 정유의 항박테리아 활성을 확인하고, 활성 정유에 대하여 1차 스크리닝을 진행하였다. 이후 최소억제농도(MIC)와 최소살균농도(MBC)를 측정함으로써 두 종류의 눈향나무 정유 중 항박테리아 활성을 나타냈던 정유의 미생물 생장 억제 농도를 정량 하였다. TLC 평가로 정유 내 활성물질을 구명하였으며, prep. TLC를 통해 해당 활성 분획을 획득하였다. 또한 주사전자현미경을 통해 활성 분획이 처리된 균주의 세포벽 파괴 현상을 관찰하였다. 활성 분획 내 단일 파이토케미컬의 항박테리아 활성을 측정하였으며, 이들 간의 상호작용은 체커보드 방법과 성장곡선 추적 법을 통해 확인하였다. 본 연구를 통해, sabinene, elemol, terpinen-4-ol, α-copaen-11-ol 및 γ-terpinene을 다량 함유한 눈향나무 정유 (NFSV 정유)가 식중독 균주에 대해 더 높은 활성을 가진다는 것을 밝혔다. 항균 평가 결과, 고활성을 띄었던 NFSV 정유는 시험 그람양성균에 대해 높은 활성을 나타낸 반면, 그람음성균의 경우 상대적으로 낮은 활성을 보였다. TLC-DB 유도 스크리닝을 통해, 그람양성균은 NFSV 정유가 분획 된 TLC 판 상에서 생장이 억제되었으나, 그람음성균의 경우 분획 된 TLC 판 상에서는 생장억제가 발생하지 않았다. 해당 생장억제 영역의 주사전자현미경 이미지에서는, 균주 세포벽을 손상 및 파괴가 관찰되었고, 이를 통해 활성물질에 의한 균주의 세포벽 파괴 및 생장 억제를 입증하였다. 특히 2D TLC-DB 결과, NFSV 정유 내의 항박테리아 활성물질 중 elemol, γ-eudesmol, terpinen-4-ol이 다량 검출되었다. 앞선 결과를 바탕으로 세가지 주요 화합물의 그람양성균에 대한 조합효과를 구명하였다. Elemol, γ-eudesmol은 L. monocytogenes와 S. aureus에 대하여 모두 뛰어난 생장억제 효과를 나타냈다. Elemol과 γ-eudesmol은 균주 생장억제에 직접적으로 영향을 미치는 반면, terpinen-4-ol은 상대적으로 낮은 활성을 나타내며 간접적으로 균주 생장억제에 영향을 미칠 것으로 사료된다. 체커보드법을 통한 isobologram 결과, L. monocytogenes에 대하여 terpinen-4-ol이 elemol 혹은 γ-eudesmol과 함께 투입되었을 때 해당 조합이 시너지 효과를 보임을 밝혔다. 체커보드 분석을 통해 평가한 두 그람양성균인 L. monocytogenes과 S. aureus에 대하여 elemol과 terpinen-4-ol의 조합에서 MIC 값을 감소됨을 확인하였고, 이들 균주의 생장곡선 추적 결과 elemol/terpinen-4-ol 조합이 시너지 효과를 나타냄을 입증하였다. 자연에서 쉽게 획득할 수 있는 모노터페노이드인 terpinen-4-ol에 미량의 elemol 성분이 첨가됨으로써 항박테리아 활성을 크게 증폭시켰다. 이러한 시너지 효과는 식음료 산업에서 천연 항균제로의 잠재성을 향상시키며, 자연 유래 세스퀴터페노이드 기반 파이토케미컬의 산업적 활용가능성을 증진시킬 수 있을 것으로 기대된다.

With the emergence of antibiotic-resistant microbes (ARM), developing new antibiotics that exhibit a prompt response to varying foodborne pathogenic bacteria has become crucial. In recent years, phytochemicals derived from plant essential oils (EOs) have drawn attention as natural antimicrobials. Crude EOs have been suggested as excellent antimicrobial agents, although data on each phytochemical present in the EOs and their interactions are insufficient. Of the plant-derived active phytochemicals such as terpenoid and phenolics, some sesquiterpenoid are difficult to isolate, hindering the analysis of their antimicrobial activity and interaction with other phytochemicals. This study aimed to identify the active sesquiterpenoid from new plant resources by using thin layer chromatography-direct bioassay (TLC-DB) and a multi-criteria analysis approach of preparative. The EOs were extracted from the leaves of two Sargent juniper varieties harvested at different altitudes in the Republic of Korea. The antibacterial activities of Sargent juniper EOs against gram-positive (Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus) and gram-negative bacteria (Salmonella typhimurium and Escherichia coli O157:H7) were first screened using the disk diffusion method. The active Sargent juniper EOs were quantitatively analyzed by measuring the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC). The active phytochemicals in the EOs were screened by TLC assay, and the active fractions were collected using preparative TLC (prep. TLC). Scanning electron microscopy (SEM) revealed structural deformation of the bacterial cell wall after treatment with the active fractions. The antibacterial activity of each active compound and the combinational interactions between the active compounds were measured using the checkerboard and growth curve assay. In this study, Sargent juniper EO containing sabinene, elemol, terpinen-4-ol, α-copaen-11-ol, and γ-terpinene exhibited higher antibacterial activities against the tested foodborne pathogens. In particular, antibacterial screening assay indicated that the active EO (NFSV EO) exhibited prominent growth inhibitory activity against the tested gram-positive bacteria, but not as much against the tested gram-negative bacteria. The two dimensional (2D) TLC-DB-guided screening showed growth inhibition of gram-positive bacteria on the fractionated TLC plate, but not of gram-negative bacteria. SEM images showed the destruction of the bacterial cell wall of gram-positive bacteria in the inhibition zone by the active compounds. The results of 2D TLC-DB revealed that the three most abundant compounds—elemol, γ-eudesmol, and terpinen-4-ol—were fractionated and identified using GC-MS. The combinational effects of the three major compounds were investigated against the gram-positive bacteria. Elemol and γ-eudesmol exerted remarkable antibacterial activities against L. monocytogenes and S. aureus. These results indicated that elemol and γ-eudesmol might directly cause bacterial growth inhibition, whereas terpinen-4-ol exhibited relatively low activity and indirectly affected bacterial growth. According to the isobologram obtained using the checkboard assay, terpinen-4-ol applied with elemol and γ-eudesmol exhibited synergism, as the fractional inhibitory concentration index (FICI) of each combination was 0.375 and 0.25 against L. monocytogenes, respectively. In particular, the combination of elemol and terpinen-4-ol synergistically reduced the MIC against both L. monocytogenes and S. aureus. The bacterial growth inhibition activity was boosted by adding a trace amount of elemol to EOs containing terpinen-4-ol, the monoterpenoid commonly available in nature. These combinations might be utilized as potential natural antibacterial agents in the food and beverage industry.