Toxicological interpretation of pentachlorophenol through metabolomic and proteomic analysis in adult zebrafish

Abstract

Pentachlorophenol (PCP) has been used as an insecticide and wood preservative, and classified as a carcinogenic grade 2B. Since PCP could be exposed to aquatic organisms through the environment contamination due to its high chemical stability, the toxic mechanisms of PCP in adult zebra fish was investigated using targeted metabolomics with GC-MS/MS and proteomics with LC-orbitrap-MS/MS. Zebra fish was exposed to PCP in three groups including control, low exposure group (1/10 LC50) and high exposure group (LC50) for 48 h. In the case of GC-MS/MS, 397 individual metabolites were analyzed on multiple reaction monitoring mode to identify 180 metabolites. Statistical analysis was performed with SIMCA+ and Metaboanalyst 4.0. Three groups were well separated on principal component analysis (PCA) or partial least squares‐discriminant analysis (PLS-DA), and 74 metabolites were selected as biomarkers through variable importance in the projection (VIP) and analysis of variance (ANOVA) tests to construct heat map. Oxidative stress caused by PCP was also confirmed through MDA and ROS assay. Eight metabolic pathways were observed to show toxicologically significant alteration. Proteomics was performed with control and high exposure group to identify 2108 proteins, of which 376 proteomic biomarkers were selected through fold change screening. Gene ontology (GO) analysis of those proteomic biomarkers revealed protein expression level in biological process, molecular function and cellular components were altered. Integrated metabolic pathways of metabolomic/proteomic perturbation were proposed including pentose phosphate pathway, pentose and glucuronate interconversions, phenylalanine metabolism, ascorbate and aldarate metabolism, taurine and hypotaurine metabolism, alanine, aspartate and glutamate metabolism and β-alanine metabolism. Such perturbation of metabolomics/proteomic pathway in zebrafish by PCP results in significant toxicological effects and activation of defense mechanisms.

Pentachlorophenol (PCP)는 살충제나 나무 보존제의 용도로 사용되어왔고 발암가능성 2B 등급으로 지정된 물질이다. PCP는 그 구조상 화학적인 안정성을 지녀 쉽게 분해되지 않아 환경에서 잔류할 확률이 높다. 이러한 PCP의 특성상, 환경 잔류를 통해 수중 생태계에 노출될 수 있어 이번 연구에서는 GC-MS/MS를 이용한 표적 대사체학 방법와 LC-Orbitrap-MS/MS을 통한 단백질체학 방법를 연계함으로써 zebrafish 성체 내에서의 독성 메커니즘을 규명해보고자 하였다. 48시간동안 3그룹의 zebrafish는 PCP에 각각 0, 1/10 LC50, LC50 수준으로 노출되었다. GC-MS/MS의 multiple reaction monitoring (MRM) mode를 통하여 총 397개의 대사체가 분석되었고 그중 180 성분이 확인되었다. SIMCA+와 Metaboanalyst 프로그램을 활용하여 통계적인 분석을 수행하였다. 3 그룹은 principal component analysis (PCA)와 partial least squares‐discriminant analysis (PLS-DA), 2 모델에서 통계적으로 유의미하게 분리되는 것을 확인할 수 있었다. 180 성분 중 variable importance in the projection (VIP) 과 analysis of variance (ANOVA) tests 를 통해서 총 74종의 대사체 바이오마커를 선정하였고 heatmap을 구성하였다. PCP에 의한 산화적 스트레스는 MDA와 ROS assay를 통해서 확인되었다. 대사체를 통해서는 독성학적으로 교란된 총 8가지의 대사경로 확인할 수 있었다. 이 후, control과 high exposure group에 한하여 단백질체학을 진행하여 총 2108개의 단백질이 검출되었다. 그중 fold change와 p-value를 통해서 376개의 바이오마커를 선정하였다. 단백질 바이오마커의 기능적인 분류에 따른 단백질을 확인하고자 gene ontology analysis를 수행하였다. 이후 대사체학/단백질체학의 바이오마커를 통합하여 integrative metabolic pathways를 도출한 결과 총 7가지의 유의미한 pathway를 확인하였다: pentose phosphate pathway, pentose and glucuronate pathway, phenylalanine metabolism, ascorbate and aldarate metabolism, taurine and hypotaurine metabolism, alanine, asparatate and glutamate metbaolism and β-alanine metabolism. PCP에 노출되었을 때 이러한 대사체학과 단백질체학의 연계 대사경로상의 변화는 독성학적으로 유의미한 효과와 방어기작의 활성을 나타내는 결과를 초래한 것으로 확인된다.