Application of Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy for Quantitative Analysis and Use in Meat Science

Abstract

Overall summary in Korean

최근 정량분석기기의 발달로 인해 계량화학적 접근방법이 점차 증가하고 있다. 그 중 핵자기공명분광학(NMR spectroscopy)을 기반으로 한 분석방법은 복잡했던 방식을 값싸고 빠르게 처리할 수 있으며, 더욱이 이해가 부족한 현상이나 상황에 빠르게 포착하고, 특정 표적물질에 관계없이 측정하여 정보를 얻을 수 있다. 하지만 식육과학에서 핵자기공명이 이용된 역사는 상대적으로 짧으며, 정량성을 확보하기 위해서는 핵자기공명분광학의 분광학적 특성 중 정량분석에 중요한 완화시간(relaxation time)과 추출물의 pH, 염농도(salt concentration)와 같은 화학적 특성들이 충분히 고려되어야 한다. 따라서, 식육샘플을 이용한 정확한 정량분석을 위해 1) 식육의 극성대사체 추출 방법 및 1차원 수소(1H) 핵자기공명의 정량방법을 확립한 후, 2) 2차원 1H-13C 이핵 단일 간섭성(HSQC)을 이용한 정성 및 정량 가능성을 확인하고, 3) 이를 바탕으로 우육의 숙성에 따른 변화 및 숙성방법에 따른 차이를 측정할 수 있는지와, 4) 계육 닭가슴살의 신선도와 냉해동되어 유통되는 닭가슴의 차이를 확인할 수 있는지 검증하였다. 실험 Ⅰ에서는 계육을 시료로 하여 3가지의 추출용매(0.6 M perchloric acid, 20 mM phosphate buffer, methanol/water 1:1)와 3가지의 20 mM의 서로 다른 버퍼를 기반으로 한 재생용매(MOPS, HEPES, phosphate)를 이용하여 핵자기공명분광기에 최적의 조합을 찾고, 조합결과를 기반으로 정량성을 최적화하였다. 총 9가지 조합에서, 과염소산(perchloric acid)을 이용한 추출이 재생용매에 관계없이 베이스라인이 바르게 나타났으며, 때문에 스펙트럼에 필요 없는 피크를 발생시킬 수 있는 유기용매인 MOPS와 HEPES 대신 인산(phosphate)을 이용한 버퍼 용매 조합이 식육의 극성대사체를 분석하는데 적당하다고 판단되었다. 이를 바탕으로 핵자기공명분광 측정방법을 이용해 용매의 제거 차이를 바탕으로 용매를 제거하지 않는 zg30와 용매를 제거하는 noesypr1d 방법을 이용하여 표준물질을 이용하여 스핀-격자이완(T1 relaxation) 및 정량성을 확인하고 계육을 이용하여 두 방법 및 액체크로마토그래피(HPLC)와 비교한 결과, 전체적으로 정량성이 동일하게 나타났으나, zg30이 측정시간이 짧으면서도 재현성과 민감도가 좋고, 상대표준편차도 작게 나타났다. 따라서, zg30을 이용한 방법으로 최적화하였으며 돈육 및 우육에도 적용하여 핵자기공명 분광 측정법을 계육 뿐만 아니라 다른 품종에도 적용할 수 있음을 확인하였다.

실험 Ⅱ에서는 닭가슴살을 추출하여 HSQC를 바탕으로 이차원 핵자기공명 분석 방법의 가능성을 확인하고, 이를 바탕으로 다변량분석을 통해 시료의 차이를 분석하였다. 분석에는 상용 토종닭을 비롯한 신품종 토종닭 3품종 (A, C, D)와 육계(cobb 500f)가 사용되었다. 우선 정량분석의 유효성을 확인하기 위해 일반 육계를 시장에서 구매하여 추출한 뒤 1차원 핵자기공명분광학(1D qNMR), 2차원 핵자기공명분광학(2D qNMR), 그리고 HPLC를 사용하여 유리아미노산을 정량분석하였다. 실험결과, 2D qNMR은 1D qNMR에 비해 훨씬 많은 대사체를 분리하였으나, 부분적으로 정량값이 일치하지 않았다. 이는 표준물질(standard mixture)과의 화학적인 환경이 다른 것으로 판단되나, 각각의 농도에 따른 선형성은 잘 나타나 수적인 정량에는 1D qNMR과의 혼용이 추천되나, 일반적인 분석은 바로 가능함을 알 수 있었다. 이를 바탕으로 계육에 존재하는 다양한 물질들을 정량한 뒤, 다변량분석을 이용하여 비교하였다. 토종닭 중에서는 신품종 D가 다른 품종에 비해 높은 유리아미노산, 당, 생리활성물질을 나타내었다. 또한 눈에 띄는 차이가 토종닭과 육계에서 나타났는데, 토종닭은 높은 수준의 이노신 일인산(inosine 5-monophosphate), α-포도당, 안세린, 젖산을 가지나 육계에 비해 유리아미노산과 관련물질들이 낮게 나타났다. 이를 통해 2D qNMR과 다변량분석을 이용하여 품종구별에 사용할 수 있음을 확인하였다. 실험 Ⅲ에서는 우육 등심(longissimus lumborum)을 4주간 건식과 습식숙성하면서 숙성 방법 간 변화와 건식숙성육의 크러스트(crust)에 대한 대사적 변화를 분석하였다. 샘플은 0.6 M의 과염소산을 통해 추출하였고 2D qNMR 분석을 진행하였다. 부분 최소 제곱법(PLS)를 기반으로 하였을 때, 분산(R2 = 0.967)과 예측능력(Q2 = 0.935)이 우수하게 나타났다. 크러스트의 경우 가식부위인 건식숙성육, 습식숙성육과 주성분분석에서 숙성 1주부터 다른 양상을 보임을 확인하였으며 2주째에 완전히 분리됨을 확인하였다. 더욱이 핵자기공명분광학을 기반으로 한 다변량분석은 숙성의 방법과 정도에 따른 차이를 잘 나타내는것으로 나타났다. 그 중, 크러스트는 독특한 대사적 변화로 빠른 단백질 분해(proteolysis)와 이노신 일인산(inosine 5-monophosphate)의 감소가 나타나면서 독특한 미생물 대사체로 인독실 황산염(3-indoxyl sulfate)와 감마 아미노뷰티르산(γ-aminobutyric acid)의 생성이 확인되었고, 아스파라긴, 글루타민, 트립토판, 당의 농도가 유지되거나 감소되는 양상을 보였다. 건식육은 크러스트와 비교해 바이오제닉아민과 생리활성물질, 감마 아미노뷰티르산의 양상이 비슷하면서도 아미노산이나 당의 감소가 관찰되지 않았다. 이러한 결과를 바탕으로 크러스트는 미생물의 침입을 막아 습식숙성육과 비슷하게 숙성이 되게 하면서도 크러스트 표면에서 일어나는 미생물의 독특한 변화를 통해 건식숙성육 특유의 성질을 나타나게 하는것으로 보인다. 본 실험을 통해 식육의 숙성 중 생화학적 변화를 핵자기공명 분광학으로 쉽게 확인할 수 있음을 알 수 있었다. 실험 Ⅳ에서는 닭가슴살(M. Pectoralis major)의 저장일차에 따른 대사적 변화와 신선육과 냉/해동육 닭가슴살의 대사적 차이 및 미생물과 물리화학적 변화를 관찰하고 핵자기공명분광학을 통해 신선도와 냉해동육의 분별이 가능한지 확인하였다. 닭가슴살은 함기포장하여 2°C에 16일간 저장하였고, 이를 분석하였다. 총 호기성 미생물(total aerobic bacteria, TAB) 6 log CFU/g를 닭가슴살 신선도 기준으로 하였을 때 TAB의 기준과 함께 유의적으로 변화하는 것은 휘발성 염기태 질소(volatile basic nitrogen, VBN)가 유일했다. 드립의 양이나 색도, 지질산화정도 또한 시간에 따라 증가는 하나, 총 호기성 미생물의 수치에 따른 민감한 변화를 나타내지 못하였다. 저장기간동안 신선육과 냉/해동육에 관계없이 유기산, 유리아미노산, 생체아민, 그리고 하이포잔틴이 증가하면서 다이메틸글리신과 이노신 일인산, 프롤린은 감소하는 공통적인 경향을 보였다. VBN을 기반으로 상관관계를 보았을 때, 가장 상관관계가 큰 것은 아세트산으로 나타났으며 이는 계육의 드립에서도 같은 양상을 보였다. 50개의 대사체 중, 이원분산분석을 통해 Con과 FT의 차이를 보았는데, 결과를 통해 11개의 대사체를 선정하였고, 이를 기반으로 Con과 FT가 잘 구별됨을 확인하였다. 이러한 차이는 글루타민과, 디아미노피멜산, 아르기닌, 감마 아미노뷰티르산에서 다른 양상을 보이고 프롤린이 감소하는 양상을 보였다. 또한 특징적인 차이로 FT에서 카르노신의 유의적인 감소가 나타났고 이와 같이 베타알라닌과 히스티딘의 유의적인 차이가 동시에 관찰되었다. 이는 두 그룹 모두 일자에 따른 농도 변화를 나타내지 않아 냉/해동의 결과로만 카르노신의 변화가 일어나는것으로 보인다. 이러한 결과를 바탕으로, 핵자기공명분광법을 이용하여 계육의 신선도를 예측할 수 있고 Con과 FT처럼 다른 상태의 샘플을 구별할 수 있음을 확인하였다. 이상의 연구 결과 핵자기공명분광분석법을 이용하여 식육의 대사물질을 정성 및 정량 분석할 수 있는 최적의 방법을 구축하였다. 이를 기반으로 닭의 품종간 대사체적 차이와 구별, 우육의 숙성 방법 및 부위에 따른 대사체적 차이와 구별, 그리고 저장기간과 저장방법 (신선 및 냉동 후 해동)에 따른 대사물질의 변화와 구별에 대해 구명하고 설명할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 핵자기공명분광학은 식육을 이용한 연구에서 우리가 지금까지 인지하지 못했던 다양한 생화학적 변화에 대한 실마리를 풀어줄 수 있는 유용한 분석방법으로 사료된다.

Overall Summary

Nuclear magnetic resonance (NMR)-based analyses are originally employed to determine the chemical structures of compounds. In addition, NMR offers both nonbiased and panoramic views, and its quantitative application has increased considerably. However, the accurate analysis of biological samples, which are basically complex mixtures, using NMR spectroscopy is challenging. The biological samples could display an unflattened baseline, overlapping peaks, different T1 relaxation time, and varied chemical shift, yielding inaccurate quantitative results. In addition, multivariate analysis is usually performed to obtain insights into the NMR data. However, in meat science, related analysis is rare. Therefore, in this study, experiments were conducted to 1) optimize the quantitative proton (1H) NMR conditions, 2) confirm the possibility of two-dimensional quantitative NMR analysis, and 3) apply chemometrics using quantitative NMR (qNMR) to meat considering various aspects, including the breed, aging, and storage conditions.

Experiment Ⅰ. Optimization of 1D 1H quantitative nuclear magnetic resonance (NMR) conditions for polar metabolites in meat The objective of this study was to establish an optimized 1D 1H quantitative nuclear magnetic resonance (qNMR) analytical method for analyzing polar metabolites in meat. Three extraction solutions [0.6 M perchloric acid, 10 mM phosphate buffer, water/methanol (1:1)], three reconstitution buffers [20 mM 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid, 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid, phosphate buffer], and two pulse programs (zg30, noesypr1d) were evaluated. Extraction with 0.6 M perchloric acid and 20 mM phosphate resulted in a stable baseline and no additional overlap for quantifying polar metabolites in chicken breast. In qNMR analysis, zg30 pulse program (without water-suppression) showed smaller relative standard deviation (RSD) and faster running time than noesypr1d (water-suppression). High-performance liquid chromatography was compared with qNMR analyses to validate accuracy. The zg30 pulse showed good accuracy and lower RSD. The optimized qNMR method was able to apply for beef and pork samples. Thus, an optimized 1D 1H qNMR method for meat metabolomics was established.

Experiment Ⅱ. Potential of 2D qNMR spectroscopy for distinguishing chicken breeds based on the metabolic differences Two-dimensional quantitative NMR spectroscopy (2D qNMR) was set up and multivariate analyses were performed on metabolites obtained from breast meat extracts of broilers and four native chicken (KNC) strains. It can accurately identify more metabolites than 1D 1H NMR via separation of peak overlap by dimensional expansion with good linearity, but has a problem of numerical quantification; Complementation of 1D and 2D qNMR is necessary. Among breeds, KNC-D had superior breast meat quality because of higher amounts of free amino acids, sugars, and bioactive compounds than others. Noticeable differences between KNCs and broilers were observed; KNCs contained higher amounts of inosine 5-monophosphate, α-glucose, anserine, and lactic acid, and lower amounts of free amino acids and their derivatives. The 2D qNMR combined with multivariate analyses distinguished the breast meat of KNCs from broilers but showed similarities among KNCs. Also, 2D qNMR may provide fast metabolomics information compared to conventional analysis.

Experiment Ⅲ. Characteristic metabolic changes of the crust from dry-aged beef using 2D NMR spectroscopy Two-dimensional quantitative nuclear magnetic resonance (2D qNMR)-based metabolomics was performed to understand characteristic metabolic profiles in different aging regimes (crust from dry-aged beef, inner edible flesh of dry-aged beef, and wet-aged beef striploin) over 4 weeks. Samples were extracted using 0.6 M perchlorate to acquire polar metabolites. Partial least squares-discriminant analysis showed a good cumulative explained variation (R2 = 0.967) and predictive ability (Q2 = 0.935). Metabolites of crust and aged beef (dry- and wet-aged beef) were separated in the first week and showed a completely different aspect in the second week via NMR-based multivariable analyses. Moreover, NMR-based multivariable analyses could be used to distinguish the method, degree, and doneness of beef aging. Among them, the crust showed unique metabolic changes that accelerated proteolysis (total free amino acids and biogenic amines) and inosine 5-monophosphate depletion than dry-aged beef and generated specific microbial catabolites (3-indoxyl sulfate) and γ-aminobutyric acid (GABA), while asparagine, glutamine, tryptophan, and glucose in the crust were maintained or decreased. Compared to the crust, dry-aged beef showed similar patterns of biogenic amines, as well as bioactive compounds and GABA, without a decrease of free amino acids and glucose. Based on these results, the crust allows the inner dry-aged beef to be aged similarly to wet-aged beef without microbial effects. Thus, 2D qNMR-based metabolomic techniques could provide complementary information about biochemical factors for beef aging.

Experiment Ⅳ. Prediction of chicken freshness and classification of fresh and frozen/thawed meat based on NMR-spectroscopy We identified key metabolites reflecting microbial spoilage and differentiated fresh meat from frozen/thawed (FT) using 2D qNMR analysis. Fresh and FT chicken breasts were prepared, individually aerobically packaged, and stored for 16 days at 2 °C. Only volatile basic nitrogen (VBN) was significantly changed after 6 log CFU/g of total aerobic bacteria (p < 0.05). Extended storage resulted in an increase in organic acids, free amino acids, biogenic amines, and hypoxanthine and a decrease in N,N-dimethylglycine, inosine 5-monophosphate, and proline. Acetic acid demonstrated the highest correlation with VBN (r = 0.97). Fresh and FT breast meat can be differentiated by uniform concentration of carnosine, β-alanine, and histidine levels, consistent changes in nucleotides by storage time, and changes in microbial metabolism patterns that are reflected by some free amino acids. Thus, NMR-based metabolomics can be used to evaluate chicken breast meat freshness and distinguish between fresh and FT meat.