Changes in cerebellar protein expression and Purkinje cell excitability by cerebellum-dependent motor learning

Abstract

신경 과학에서 뇌의 고등 기능 중에 하나인 학습과 기억이 어떤 분자 혹은 세포 기전에 의해 매개되는가 하는 것은 흥미로는 주제이다. 이 문제를 해결하기 위한 다양한 실험적 접근들 중에서 야생형 동물의 뇌에서 학습 이후 나타나는 흔적을 추적하는 일은 근본적으로 널리 사용되어오는 접근법이다. 학위과정동안 나는 소뇌-의존적 운동 기억이 소뇌의 분자적 그리고 세포 수준에서 남기는 흔적들에 대한 탐구를 진행하였다. 먼저 제1장에서는 소뇌-의존적 학습이 소뇌의 분자적 수준에서 남기는 흔적을 찾기 위한 시도를 하였다. 소뇌는 운동의 강도를 적절하게 조정하여 운동 능력을 향상시키는데, 기존 연구에 따르면 운동의 강도가 조절되는 방향에 따라 각각 다른 종류의 세포 기전이 존재할 수 있다는 가능성이 제기되었다. 기억의 형성과 유지에 있어서 새로운 단백질의 합성이 필수적이라는 사실을 고려하여, 나는 운동의 강도 조절 측면에서 서로 다른 방향의 운동 학습이 소뇌에서의 서로 다른 단백질군의 발현을 유도할 것이라는 가설을 세웠다. 나는 운동의 강도가 강해지거나 약해지는 방향으로 일어나는 서로 다른 3 가지 종류의 소뇌-의존적 안구 운동 학습을 겪은 생쥐에서 학습이 끝난 후 1 시간과 24 시간이 지난 소뇌에서 단백질 발현 수준을 단백체 프로파일링을 사용하여 정량하였다. 실험의 결과, 3 가지 학습 패러다임 학습 후 1 시간과 24 시간의 각 소뇌에서 총 43 개의 차발현 단백질을 발견하였다. 또한, 기능적 온톨로지 분석을 사용하여 세 가지 안구 운동 학습 후 24 시간이 지난 소뇌에서 통제군에 비해 발현이 증가하거나 감소한 단백질 그룹을 확인하였는데, 이 결과는 세 가지 안구 운동 기억의 형성에 있어서 별개의 생물학적 경로가 관여할 수 있음을 제안한다. 가중 상관 네트워크 분석을 실시하여 안구 운동 기억 학습량과 상관 관계가 있는 단백질 그룹을 발견하였다. 마지막으로, 이 단백질 그룹 중 4 가지 단백질(Snca, Sncb, Cttn 및 Stmn1)을 선택하여 단백체 프로파일링의 결과를 웨스턴블롯분석으로 검증하였다. 이 연구는 세 가지 소뇌 의존적 운동 학습 패러다임과 관련된 종합적인 단백질 목록을 제공하는데, 연구의 결과는 각 학습 패러다임이 소뇌에서 서로 구별되는 단백질군의 발현을 유도할 수 있다는 점을 시사한다. 제2장에서는 앞서 언급한 3 가지 학습 패러다임 중에서 시운동 반응 적응 현상을 가지고 진행한 연구이다. 시운동 반응은 시야의 움직임이 발생하면 이를 추종하는 반사적 안구 운동으로 망막에 안정된 물체의 상이 맺힐 수 있도록 돕는 역할을 한다. 시운동 반응은 환경의 변화에 따라 그 반응의 정도가 조절되는 특성을 가지는데, 이런 적응 과정에 소뇌가 관여한다. 소뇌에 존재하는 여러 신경세포들 중, 퍼킨지 세포는 소뇌 피질로 전달된 여러 감각 정보들을 통합하고 소뇌의 유일한 출력을 담당하는 것으로 알려져 있는데, 이와 같이 시운동 반응을 통제하는 신경 회로 상 퍼킨지 세포의 중요성에도 불구하고 시운동 반응 적응 학습 상황에서 소뇌 퍼킨지 세포의 전기생리학적 특성을 밝히려는 시도는 여전히 부족한 것이 사실이다. 따라서 본 연구에서 나는 시운동 적응 학습 이후 소뇌 퍼킨지 세포에서의 내재적 및 스냅스 흥분성의 변화가 유발되는지 여부를 확인하였다. 통제군과 50분의 시운동 학습을 마친 학습군에서 소뇌를 각각 얻은 후 퍼킨지 세포에서 전기생리학적 특성을 분석한 결과, 나는 학습군의 퍼킨지 세포에서 통제군에 비해 세포내 탈분극 전류 주입에 반응하여 나타나는 활동 전위의 발화율이 줄어들고, 레오베이스 전류가 커졌음을 발견하였다. 또한, 시운동 적응 학습은 시냅스 전 신경 전달 물질 소포의 방출 확률을 감소시킴으로써 소뇌 평행섬유와 퍼킨지 세포 사이의 흥분성 시냅스 전달을 약화시켰다. 2장의 연구 결과를 종합하면, 시운동 적응 학습은 소뇌 퍼킨지 세포의 내재적 및 시냅스 수준 모두에서 신경 흥분성의 약화를 유발하는데, 이는 소뇌-의존적 안구 운동 학습을 매개하는 다중 가소성의 존재 가능성을 시사한다. 이 논문에서 나는 소뇌-의존적 운동 기억이 소뇌의 분자 그리고 세포 수준에서 남기는 기억 흔적을 찾기 위해 두 가지의 관찰 연구를 수행하였다. 탐구와 분석을 통해 찾은 후보 단백질과 신경 가소성은 운동 기억 형성 및 고착화 과정에 실제로 관여하는지 여부를 검증하는 후속 연구로 이어져 할 것이다. 결론적으로, 이 논문은 소뇌-의존적 운동 기억을 매개하지만 기존에 알려져 있지 않은 분자 또는 신경 가소성의 발견을 촉진하는 중요한 자원이 될 수 있을 것이다.

One of the fundamental questions in neuroscience is how the brain encodes learning and memory processes at the molecular and cellular levels. Of the various approaches to resolve this question, it is useful to investigate the molecular or cellular traces that are formed in the brain after learning in wildtype animals. In this dissertation, I attempted to find traces of cerebellum-dependent motor memory at the molecular and cellular levels in the cerebellum. First, in chapter Ⅰ, I attempted to find the trace of cerebellum-dependent motor memory at the molecular level of the cerebellum. The cerebellum improves motor performance by adjusting the motor strength appropriately. According to previous studies, it has been suggested that distinct cellular mechanisms may exist depending on the direction in which the motor strength is adjusted. Given that de novo protein synthesis is essential in the formation and retention of memory in the brain, I hypothesized that motor learning in the opposite direction would induce a distinct pattern of protein expression in the cerebellum. I conducted quantitative proteomic profiling to compare the level of protein expression in the cerebellum at 1 and 24 h after training from mice that underwent different paradigms of cerebellum-dependent oculomotor learning from specific directional changes in motor gain. I quantified a total of 43 proteins that were significantly regulated in each of the three learning paradigms in the cerebellum at 1 and 24 h after learning. In addition, functional enrichment analysis identified protein groups that were differentially enriched or depleted in the cerebellum at 24 h after the three oculomotor learnings, suggesting that distinct biological pathways may be engaged in the formation of three oculomotor memories. Weighted correlation network analysis discovered groups of proteins significantly correlated with oculomotor memory. Finally, four proteins (Snca, Sncb, Cttn, and Stmn1) from the protein group correlated with the learning amount after oculomotor training were validated by Western blot. This study provides a comprehensive and unbiased list of proteins related to three cerebellum-dependent motor learning paradigms, suggesting the distinct nature of protein expression in the cerebellum for each learning paradigm. In chapter Ⅱ, I focused on the optokinetic response (OKR) learning among the three oculomotor paradigms mentioned above. The OKR is a reflexive eye movement evoked by a motion of the visual field to stabilize an image on the retina. The OKR is known to adapt its strength to cope with an environmental change throughout life. The cerebellum is well-known to participate in this oculomotor learning as an adaptive controller. In the adaptive controlling unit, the Purkinje cell (PC) is known to integrate multimodal sensory information in the cerebellar cortex as the sole output of the cerebellum. Despite the significance of PC in the neural circuit modulating OKR, the electrophysiological properties of PC in optokinetic learning have not been fully understood. Therefore, in this dissertation, I examined whether changes in the intrinsic and synaptic excitability of PC is induced in mice underwent 50 min of optokinetic learning. By utilizing the whole-cell patch-clamp recording, I compared the electrophysiological properties between the control and learned group, and found that the mean firing rate of PCs was decreased in response to intracellular depolarizing current injection and the rheobase current was increased in the learned group. In addition, I found that acute optokinetic learning induced a decrease in excitatory synaptic transmission at parallel fiber to PC synapse by reducing the presynaptic release probability. Taken together, optokinetic learning induces the suppressed neuronal excitability at both the intrinsic and synaptic factors of cerebellar PCs, suggesting the possibility of the occurrence of multiple plasticity governing cerebellum-dependent motor learning. In this dissertation, I conducted two independent observational studies to suggest possible molecular and cellular traces for cerebellum-dependent motor memory. Identified proteins and neural plasticity should lead us to further investigations to validate their roles in memory formation and consolidation. In conclusion, the discoveries in this dissertation would be a potentially important resource for discovering unknown molecules or plasticity mechanisms underlying cerebellum-dependent motor memory.