Development of Intracellular Delivery Methods using α-Helical Cell Penetrating Peptides and Affibody Proteins

Abstract

The cell membrane is an important barrier which protects the cells from the surroundings. The cell membrane is composed of lipid bilayer containing various membrane proteins and carbohydrates. This important structure works as a semi-permeable filter that manages the exchange of materials inside and outside the cells which means cells uptake materials very precisely and selectively. For examples, ions or small hydrophilic nutrients usually use specific channels or transporter proteins to enter the cells whereas hydrophilic macromolecules are unable to go in to the cells efficiently. This selective material transportation of cell membrane works as safeguard of the cells but at the same time, the cell membrane is the most challenging hurdles in developing therapeutic drugs using large-size molecules such as peptide, proteins, antibodies, or nucleic acids. To overcome the poor permeability of drugs, various drug delivery vehicles have been developed such as viruses, polymers, and nanoparticles. Cell penetrating peptides (CPPs), or protein transduction domains (PTDs), are short peptides that facilitate cellular uptake of various molecular cargoes. Since the transactivator of transcription (TAT) was firstly found as it has remarkable ability to across cell membrane, various artificial cell penetrating sequences have been developed and they have been widely used in various biological and therapeutic applications. In our lab, a new series of Leucine and Lysine rich α-helical cell penetrating peptides, LK peptides (LKKLLKLLKKLLKLAG), was developed. Those peptides show the cell penetrating ability in the nanomolar range which is extremely efficient compared to conventional CPPs. Furthermore, in the previous research, I found that the cell penetrating ability dramatically increases as it became multimers and the ability is saturated when the sequence is repeated four times (LK-4). However, they do not have any special functions besides high cell penetrating ability across the cell membrane. In order to give special functions to LK peptides, I proposed to introduce affibody proteins to the LK sequences. Affibody molecules, a member of antibody mimetic families, are small proteins engineered to bind to a large number of target proteins or peptides with very high affinity. The first affibody protein was found on the surface protein – the protein A - of Staphylococcus aureus and it was found that the protein A contains five different triple helix domains (E, D, A, B, C), each showing great affinity to antibody. From the domain B of protein A, scientist artificially engineered protein domain Z which can specifically bind to Fc region of immunoglobulin G without affecting Fab region. After developing the first engineered affibody domain Z, a large number of affibody has been developed from domain Z through the phage display technique. In this thesis, two types of affibody proteins – domain Z (Zwt) and ZHER2:342 – were introduced LK sequences through simple DNA recombinant technology. As already mentioned above, domain Z of protein A is known to bind to Fc region of Immunoglobulin G (IgG) with high affinity (Kd= ~50nM). The first part of the thesis started from the hypothesis that domain Z can give the Fc-binding ability to LK sequences and the recombinant protein LK-domain Z can work as an extremely efficient IgG delivery vehicle at the nanomolar concentration range. Based on various experiments, I figured out that LK-domain Z proteins bind to Fc region of IgG at specific ratio and the proteins successfully deliver IgG across the live cell membrane at nanomolar concentrations without showing any toxicity. I also revealed the penetration mechanisms and kinetics of IgG/LK-domain Z complexes. Furthermore, as a proof-of-concept, I delivered anti- NF-κB IgG to regulate specific signaling pathway of cancer cells and saw the possibility of LK-domain Z protein as an efficient IgG delivery vehicle for the future therapeutics. In the second part of the thesis, I overcame the critical limitations of various drug delivery vehicles – the lack of selectivity. Here, HER2-overexpressed breast cancer targeted cell penetrating peptide and therapeutics were developed using the affibody named ZHER2:342. ZHER2:342 is one of the affibody molecules which are derived from Domain Z from the phage display. With the changes of only 13 amino acids on the surface of domain Z, a new affibody – showing totally different characteristics to domain Z – was discovered. ZHER2:342 is known to bind to HER2 receptors (Kd= ~22pM) which are usually overexpressed on the membrane of many breast cancer cells and manage the proliferation of various cancer cells. In this study, ZHER2:342 was brought into LK-2 peptides (LKKLLKLLKKLLKL GGLKKLLKLLKKLLKLAG) through DNA recombinant technology to give them the selectivity against HER2-positive breast cancers and I named this protein as LK-2-ZHER2. As I predicted, LK-2-ZHER2 showed great targeting effect against HER2-overexpressed cells both in vitro and in vivo. Furthermore, with anti-cancer therapeutic, doxorubicin, LK-2-ZHER2 selectively killed HER2-overexpressed cells in vitro. Based on those two researches in this Ph.D thesis, it is very clear that simple introduction of affibody through DNA recombinant technology is a very simple and easy way to give special function to cell penetrating peptides. Since large number of affibody proteins were developed and are being developed, I can infinitely expand the function of cell penetrating peptides in the future.

세포는 인지질 이중층으로 이루어진 세포막으로 둘러쌓여 있다. 이러한 세포막은 세포의 내부와 외부의 물질교환을 선택적이고 효과적으로 조절하며 세포 생존에 매우 중요한 역할을 한다. 이러한 세포막 떄문에 사이즈가 크거나 세포막과 상호작용을 못하는 물질은 세포 내부로 전달 되지 못한다. 이러한 세포 비투과 물질 중에는 치료 약물로 사용가능한 항암제나 항체를 포함한 다양한 단백질 등이 포함 된다. 많은 세포 비투과 약물들이 세포에 중요한 역할을 하기 때문에, 과거부터 이러한 약물을 세포 내부로 전달하기 위한 나노입자물질, 하이드로겔, 공중합체를 포함한 많은 전달체들이 개발 되어 왔다. 세포 투과성 펩타이드 (Cell Penetrating Peptide)는 세포 비투과 물질을 효율적으로 세포내부로 전달하는 효율적인 전달체 중 하나이다. 특히 이 물질은 펩타이드로 만들어졌기 때문에 다른물질들에 비해 상대적으로 독성이 낮으며 생체적합성이 높아 널리 이용되고 있다. 과거 HIV-1로 부터 유래된 Tat (Transactivator of transcription) 펩타이드가 처음 발견 된 이후 poly arginine, penetratin 과 같은 다양한 세포투과성 펩타이드들이 개발되었고, 이들은 주로 음성 전하를 가지는 세포막과 잘 상호작용 할 수 있는 양성 전하를 띄는 아미노산들로 이루어져 있다. 이러한 세포투과성 펩타이드들은 보통 비투과물질을 수 마이크로몰랄 농도에서 적은 독성을 보이며 살아있는 세포 내부로 전달하는 것이 가능했다. 서울대학교 생체재료화학연구실에서는 기존에 존재하는 세포투과성 펩타이드 보다 훨씬 높은 효율적인, 수 나노몰랄 농도에서 작동이 가능한 새로운 종류의 양친매성(amphipathic) 성질을 세포투과성 펩타이드를 개발 하는것을 성공하였다. 새로이 발견된 이 펩타이드는 루신과 라이신이 반복되는 LK 펩타이드 이며 이것의 시퀀스는 LKKLLKLLKKLLKLAG 이다. 후속 연구에서 이 펩타이드의 시퀀스가 여러번 반복 될 수록 더 높은 세포투과 효율을 보이는 것을 알 수 있었다. LK가 두번 반복되는 LK-2 와 같은 경우에는 고체상 펩타이드 합성법으로 얻을 수 있지만, 그 이상 반복되는 펩타이드는 너무 길기 때문에 대장균 단백질 발현 방법 (E.coli protein expression)으로 얻을 수 있었고 LK가 네번 반복되는 LK-4에서 세포투과도의 효율이 가장 높았음을 알 수 있었다. 더 나아가 대장균에서 LK 시퀀스를 발현 가능 하게 함으로써 다양한 단백질 및 펩타이드 시퀀스를 DNA 재조합 기술을 이용하여 LK와 함께 한번에 정제 해 낼 수 있게 되어 LK 세포투과성 펩타이드의 다양한 활용이 가능하게 되었다. 본 박사학위 논문에서는 대장균 발현을 통한 LK 시퀀스를 이용한 두가지 활용 연구를 진행하였다. 논문의 PART I 에서는 LK 시퀀스에 항체에 선택적으로 결합이 가능하다고 알려진 Domain Z of Staphylococcus protein A를 DNA 재조합 방법으로 도입하여, 거대한 세포 비투과성 단백질인 항체를 매우 저농도에서 효율적으로 살아있는 세포 내부로 전달 하는 것을 가능하게 함으로써 새로운 항체 전달 물질 개발에 성공 하였다. 이 연구에서 만들어진 LK-Domain Z 단백질은 domain Z 파트의 영향으로 항체와 일정한 비율로 매우 효율적인 비공유성 결합을 형성한다. 그 이후 LK의 높은 세포투과성 때문에 항체가 살아있는 세포의 세포질 내부로 효과적으로 들어갈 수 있다. 본 연구에서는 이 효율적인 항체 전달물질의 성질과 그에 대한 투과 기전에 대해 밝혔으며 전달된 항체가 실제로 세포 내부에서 정확한 역할이 가능한지에 대한 연구 또한 진행 되었다. LK-Domain Z 를 이용하여 암세포의 신호전달에 관여하는 NF-κB 의 역할을 방해하는 anti-NF-κB 항체를 이용하여 실제로 암세포의 증식에 필요한 유전자의 발현이 억제되면서 세포사멸이 일어나는 것을 관찰 할 수 있었다. 이를 통해 새로이 발견된 LK-Domain Z 단백질이 세포 내부에서 작용하는 다양한 항체를 전달하여 향후 다양한 생물 세포학적 연구 및 약물 연구에 사용 가능 할 것임을 확인 하였다. 논문의 PART II 에서는 LK 시퀀스에 세포 선택성을 부여하여 표적세포에 효율적으로 작용하는 세포투과성 펩타이드 개발에 대해 서술 하였다. 수많은 약물전달체와 마찬가지로 LK 시퀀스 또한 세포 선택성이 없다는 단점을 가진다. 약물전달체가 세포에 대한 선택성을 가지면 다양한 약물의 복용량을 낮출수 있고 정상세포에 대한 부작용을 줄일 수 있는 장점을 가진다. 본 연구에서는 LK 시퀀스에 세포선택성을 부여하기 위해 20~30% 정도의 유방암 세포에 과발현 되어있는 HER2 리셉터에 특이적으로 결합이 가능하다고 알려진 ZHER2:342 (ZHER2)단백질을 DNA 재조합 방법을 통해 LK에 도입하였다. 이 연구에서 개발된 LK-ZHER2 단백질은 HER2가 없는 세포에는 아주 느리고 비효율적으로 세포투과도를 보이는 반면, HER2가 과발현 된 세포에서는 매우 빠르고 효율적인 세포투과성을 보였다. 본 연구에서는 LK-ZHER2의 세포투과성과 HER2 리셉터 발현과의 관계에 대해 밝힐 수 있었으며, LK-ZHER2 단백질에 항암제인 doxorubicin을 결합하여 세포를 선택적으로 죽이는 표적치료제로서의 역할을 in vitro 상에서 확인 할 수 있었다. 더 나아가 in vivo 에서도 이 LK-ZHER2가 HER2 과발현 세포에 매우 높은 선택성을 보인다는 것을 밝혔다. 본 박사학위 연구에서는 LK 시퀀스에 다양한 성질을 가지는 단백질은 DNA 재조합 방법으로 도입하여 새로운 기능을 가지는 세포투과성펩타이드 개발에 성공하였다. Domain Z, ZHER2 외에도 굉장히 많은 종류의 기능성 단백질들이 존재하기 때문에 위와같은 방법으로 LK에 도입이 된다면, 향후 LK는 더욱 다양한 기능을 가지는 세포투과성 펩타이드로 발전할 수 있을 것이라 기대된다.