Establishment of immune-compatible human embryonic stem cell libraries using the CRISPR/Cas9 system

Abstract

Transplants are in high demand due to the loss and injury of organs and tissues from disease, accidents, or congenital disabilities; by comparison, the donor supply of organs and tissues is far from sufficient. Therefore, human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for cell therapy because they differentiate into any cell type in the human body. However, before clinical application, immune rejection caused by highly polymorphic human leukocyte antigens (HLAs) mismatching is a significant concern to overcome. Many researchers have tried to find ways to transplant cells and tissues allogeneically without risking immune rejection. One way is to create human-induced pluripotent stem cell lines (hiPSCs) from HLA-homozygous donors with HLA haplotypes that can encompass most populations. However, screening to find HLA-homozygous donors and establishing hiPSCs is time-consuming and costly. Another method generates universal donor cells, disrupted HLA class I and class II, using genome-editing technologies. However, if HLA is not present, there is a risk of NK cell-induced immune responses and an increased risk of pathogen infection. Here, I used a CRISPR/Cas9-mediated HLA-editing strategy to generate various HLA homozygous-like human embryonic stem cell (hESC) lines from pre-established hESC lines. First, I edited pre-established HLA-heterozygous hESC lines and created a mini library of HLA-edited hESC lines containing single HLA-A and HLA-B allele and disrupted HLA-DR alleles. The HLA-edited hESC derivatives elicited both low T cell- and low NK cell-mediated immune responses. Also, I calculated how much of the population could be covered with the HLA-edited library. Furthermore, I estimated the types of HLA haplotypes and calculated the numbers of pre-established heterozygous hESC lines needed to create a HLA-edited library applicable to most of the population. Thus, this study offers an opportunity to generate an off-the-shelf HLA-compatible hESC bank, available for immune-compatible cell transplantation without embryo destruction.

질병이나 사고, 선천성 장애의 원인으로 장기·조직의 손실·상처에 따른 이식 수요가 많지만 이에 비해 장기·조직의 기증자 공급은 턱없이 부족한 실정이다. 그러므로, 인간만능줄기세포(hPSCs)는 신체의 어떤 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력 때문에 세포 치료로 이용될 가능성이 크다. 그러나, 매우 다형화된 인간 백혈구 항원 (HLA) 불일치로 인한 면역 거부반응은 임상 적용 전에 극복해야 할 중요한 문제이다. 많은 연구자들은 면역 거부반응의 위험 없이 유전적으로 다른 동종 간 세포/조직을 이식하는 방법을 찾으려고 노력해 왔다. 그 중 하나는 대부분의 인구를 아우를 수 있는 HLA 단상형을 가지고 있는 HLA-동형접합체 기증자로부터 인간 유도 만능줄기세포 (hiPSCs)를 만드는 것이다. 그러나 HLA-동형접합체 기증자를 찾고 인간 유도 만능줄기세포를 확립하는 것은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 든다. 또 다른 방법은 유전체 편집 기술을 사용하여 HLA 클래스 I과 클래스 II를 망가뜨려 보편적 기증 세포를 만드는 것이다. 다만 HLA가 존재하지 않을 경우 NK세포에 의한 면역반응의 위험과 병원체 감염의 위험이 증가한다. 여기서, 나는 면역거부반응을 일으키는 주요 결정인자인 HLA 유전자를 CRISPR/Cas9 기술을 이용하여 편집함으로써, 줄기세포를 세포치료제로 쓰는데 용이하도록 만들었다. HLA 이형접합체의 인간배아줄기세포에 CRISPR/Cas9을 도입하여 HLA-DR의 두 대립유전자를 망가뜨리고, 각각 한 개의 HLA-A와 HLA-B 대립유전자를 가진 HLA 편집 인간배아줄기세포 라이브러리를 만들었다. HLA가 편집된 인간 배아 줄기세포의 파생세포들은 낮은 T세포와 NK세포 매개 면역 반응을 이끌어냈다. 또한, 인구별 HLA allele frequency database를 기반으로 해당 라이브러리으로 얼마나 많은 인구를 아우를 수 있는지 계산하고 더 나아가, 대부분의 인구를 포함하는데 필요한 HLA-A, B 단상형 조합들의 개수를 계산했다. 이 연구는 면역 적합한 세포이식이 가능하고 쉽게 구할 수 있는 HLA 적합 인간배아줄기세포 은행을 만들 수 있는 기회를 제공했다.