Experimental investigation of oncological biomarker detection by nanoelectrokinetic selective preconcentration

Abstract

소형화에서 오는 높은 시료 분석 효율과 시스템 제어의 용이함 등의 장점으로 인해 마이크로 유체역학은 1990년대 이후로 각광받고 있었다. 한편 나노공정기술의 발전으로 마이크로/나노유체역학 시스템에 대한 연구가 가속화되었다. 마이크로미터 아래 영역에서는 다른 영역에서 관찰되지 않았던 새로운 물리 화학적 현상들이 발견되었는데, 이 중 EDL overlap에 의한 선택적 투과성이 가장 중요한 특징으로 손꼽히고 있다. 이 선택적 투과성을 이용한 마이크로/나노유체역학 시스템을 통해 분석장치, 질병 진단, 담수화, 에너지 하베스팅 등 다양한 응용 분야에 대한 연구가 진행되고 있다. 본 학위논문에서는 혈액암의 종류인 EGFR L858R 돌연변이에 대한 검출을 시도하였으며, 다운스트림 분석을 위한 효율적인 형태의 장치를 제안하였다. 먼저, 이온 농도 분극 현상과 특정 염기서열에 결합하는 dCas9 단백질을 이용하여 타겟 혈액암 진단 연구를 수행하였다. 암 진단은 조기 진단이 중요하기 때문에 최근 현장 의료 진단 방식에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 다양한 진단 기술들 중 연쇄중합반응 방식이 가장 흔히 쓰이는데 비용과 시간이 많이 드는 등의 단점이 있다. 따라서 대안으로써 이온 농도 분극 현상과 특정 DNA와 결합하는 dCas9을 이용한 타겟 DNA 검출 연구가 발표된바 있다. 이에 대한 후속 연구로써 본 연구에서는 혈액암 중 폐암의 원인이 되는 마커 (EGFR L858R)을 전체 시료 함유량 1 %까지 낮춰가며 검출에 성공하였고 이 때, dCas9 단백질의 타겟 결합율은 함유량에 큰 상관관계 없이 약 25 % 를 유지하였다. 또한, 하나의 염기서열만 다른 경우에도 본 연구의 방법으로 성공적으로 검출할 수 있음을 보였다. 이 플랫폼을 통해 향후 on/off 방식의 혈액암 조기진단 칩으로 활용될 수 있을 것이라 기대된다. 다음으로, 효율적인 구조로 디자인된 마이크로/나노유체역학 방식의 농축 및 추출 장치를 고안했다. 나노유체역학 플랫폼에서의 다양한 농축기술 중 이온 농도 분극 현상을 이용한 농축 방식은 높은 농축율과 복잡한 버퍼 교환 과정이 필요없는 등의 장점으로 많이 연구되고 있다. 하지만 기존의 이온 농도 분극 현상 농축방식으로는 농축된 샘플을 추출하는 것이 어려웠다. 이를 해결하기 위해 본 연구에서는 간단하게 원형으로 배치된 채널 구조를 통해 농축된 샘플을 추출할 수 있었다. 원형으로 배치된 각각의 채널에서 농축이 진행되면서 용매는 밖으로 빠져나가고, 농축된 샘플을 가운데에 꼽힌 파이펫 팁을 회수해줌으로써 얻어낼 수 있었다. 간단하면서 저가형의 공정을 위해 사무용 프린터기를 개조하여 나노막을 패터닝하는데 성공하였다. 폴리스티렌 파이클, 형광입자, DNA 를 이용해 농축 및 추출 실험을 하였으며 각각 85.5 %, 79.0 %, 51.3 %의 회수율을 얻었다. 또한, 슈퍼 잉크젯 프린터를 이용해 전극을 패터닝하여 나노막 대신 이온 선택성을 구현하였다. Faradaic 반응을 이용한 전극 프린팅 디바이스를 통해 양전하 입자, 음전하 입자 모두 성공적으로 농축하는데 성공하였다. 본 연구에서 고안한 방사형 농축-추출 장치를 통해 실제 임상 환경 등에 적용할 수 있을 것이라 기대된다.

Microfluidic systems have been in the spotlight since the 1990s due to various advantages from miniaturization such as highly efficient sample analysis and ease of system control, etc. Meanwhile, the advance of nanotechnology (especially for nano structure fabrication) has accelerated the research on micro/nanofluidic platform and its applications. In the sub- mm region, new physico-chemical phenomena that were not observed in other regions were discovered. Among them, selective permeability by electrical double layer overlap is considered as a most important feature. Using this selective permeability, researches on various application fields are being conducted in micro/nanofluidic system such as sensing, disease diagnosis, desalination, and energy harvesting, etc. In this thesis, target specific binding method for blood cancer is researched and also an efficient type of micro/nanofluidic platform for downstream analysis is proposed. First, the detection of target blood gene was conducted using ion concentration polarization and target specific binding dCas9 protein. Due to the demands for early stage diagnosis on disease, point-of-care diagnostics for the detection of target gene have been actively studied these days. Among various technologies, PCR is the state-of-art technology used in genomic analysis. But it has critical limitation of high cost, time consuming and simultaneous amplification of error. As an alternative, a method of detecting specific DNA using ion concentration polarization (ICP) phenomenon and changes of the analytes mobility upon DNA-dCas9 binding has been reported. As a follow up study, this study successfully demonstrated on blood cancer marker (EGFR L858R) at reduced % of target mutation DNA to 1 % (DNA concentration ~ 0.097 nM). We also confirmed that the DNA-dCas9 binding rate was about 25 % which is not have a significant correlation with the target DNA content and detection sensitivity with 1 bp differ off-target. This platform is expected to be utilized as a on/off diagnostic chip for early detection of blood cancer later. Second, the efficiently designed micro/nanofluidic preconcentrator and online extractor was devised. Among various preconcentration strategies using nanofluidic platforms, a nanoscale electrokinetic phenomenon called ion concentration polarization (ICP) has been extensively utilized due to several advantages such as high preconcentration factor and no need of complex buffer exchange process. However, conventional ICP preconcentrator had difficulties in the recovery of preconcentrated sample and complicated buffer channels. To overcome these, bufferchannel-less radial micro/nanofluidic preconcentrator was developed in this work. Radially arranged microchannel can maximize the micro/nano membrane interface so that the samples were preconcentrated from each microchannel. All of preconcentrated plugs moved toward the center pipette tip and can be easily collected by just pulling out the tip installed at the center reservoir. For a simple and cost-effective fabrication, a commercial printer was used to print the nanoporous membrane as Nafion-junction device. Various analytes such as polystyrene particle, fluorescent dye, and dsDNA were preconcentrated and extracted with the recovery ratio of 85.5%, 79.0%, and 51.3%, respectively. Furthermore, we used a super inkjet printer to print the silver electrode instead of nanoporous membrane to preconcentrate either type of charged analytes as printed-electrode device. A Faradaic reaction was used as the main mechanism, and we successfully demonstrated the preconcentration of either negatively or positively charged analytes. The presented bufferchannel-less radial preconcentrator would be utilized as a practical and handy platform for analyzing low-abundant molecules.