Elucidation of the Biochemical Regulatory Mechanism of the Cys/N-Degron Pathway for Stress Sensing, Proteolysis and Signaling

Abstract

가변적인 환경 변화에 대한 적응은 세포 내 항상성 조절에 필수적이다. 적응을 위해서는 환경변화에 대한 인지 와 반응 두 가지 측면이 동등하게 필수적으로 작용하는데, 이 때, 단백질은 그 자신이 변화의 주체로서, 이러한 인지와 반응 매커니즘을 매개한다. 특히나 단백질은 스트레스 상황을 포함한 특정 컨디션에서 그 자신의 형태적 변경을 통해, 기본적으로 자신이 실행하던 기능에서 벗어난 새로운 기능을 수행하게 되며, 이는 단백질 자체의 안정성 조절과 전사 유도 (transcriptional induction)를 통한 양적 기능변화, 그리고 번역 후 수정 (post-translational modification) 과 같은 여러 조절기전들을 통해 일어나게 된다. 이 논문에서, 필자는 세포 내 산화적 스트레스 하에서 시스테인/N-말단 경로의 역할을 단백질의 안정성 조절과 번역 후 수정의 관점에서 다룰 것이다. N-말단 법칙은 진화적 관점에서 고도로 보존된 단백질의 조절기전으로, 모든 계(界, kingdom)를 통틀어 적용되어왔다. N-말단 법칙은 단백질이 잘려지거나 혹은 처리되며 노출되는 N-말단부의 아미노산이 단백질의 안정성을 조절한다는 단백질 분해기전의 한 줄기로, 말단부에 노출된 아미노산의 종류에 따라 다양한 가지로 나뉘어 연구되고 있다. 그 중에서도 아르기닌 N-말단 법칙의 일부인 N-말단 시스테인의 경우, 황화수소 잔기(sulfhydryl side chain)를 가지는 유일한 아미노산으로 산소 원자와 결합, 변형이 가능하다는 특이점을 가진다. 이러한 시스테인 잔기의 특이성은 자동적으로 시스테인/N-말단 법칙이 세포 내 산화 스트레스에 의한 변화의 주체로서 산화 스트레스 인지와 반응의 매개체일 것이라는 확신을 부여한다. 이 논문의 첫 부분은 세포 내에서 일어나는 산화와 환원력 사이의 섬세한 밸런스를 단백질 분해의 관점에서 풀어나갈 것이다. 세포 내 급성 저산소증과 만성적 저산소증, 그리고 만성적 저산소 상태로 인해 초래된 산화스트레스로 일어나는 단백질 변화에 대한 기전연구에 대해 논할 것이다. 특히나, N-말단에 노출된 시스테인이 이러한 상황에서 어떻게 단백질의 구조, 기능적 변화를 유도하고 그에 따른 단백질의 분해 과정까지 영향을 미치는지에 대하여 자세하게 다룰 것이다. N-말단 아르기닌화가 가능한 두가지 종류의 산화 시스테인인 시스테인 설핀산(cysteine sulfinic acid; CysO2H) 과 시스테인 설폰산 (cysteine sulfonic acid; CysO3H)은 각각 동일한 N-말단 경로 기질의 분해 방법을 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 (Ubiquitin-proteasome system) 과 오토파지-리소좀 경로 (autophagy) 로 이원화하며, 이러한 분해경로의 이원화는 N-레코그닌 E3 리가제인 UBR1/UBR2를 이용한 노선과 새로운 N-레코그닌인 KCMF1-UBR4 리가제 노선으로 분리됨에 따라 유비퀴틴 코드가 전위되며 일어나게 된다. 이러한 일련의 발견들은 아르기닌/N-말단 경로에 있어 최말단부 뒤에 위치하는 두번째 잔기의 역할이 단순히 최말단부의 데그론을 유치하는데 필요한 단순 중개자가 아닌, 결정자로서 작용하여 단백질의 분해에 있어 그 특징과 변화가 중요하다는 것을 밝혀냄으로서 두번째 위치의 N-데그론(secondary N-degron)에 대한 개념을 확장할 것이다. 또한, 이러한 시스테인 N-말단 경로를 통한 산화스트레스의 인지와 반응을 생체적 관점에서 미토콘드리아 항상성과 엮어 풀어낼 것이다. 논문의 다음 파트는 이전 파트들에서 다뤄왔던 세포 내부의 산화 스트레스를 인지 및 반응을 세포간 통신을 통한 외부 세포-세포 간 반응의 영역으로 확장한다. 필자는 이러한 산화스트레스에 대한 세포간 신호전달에 있어 아르기닌/N-말단 경로가 작용하는 기전에 대해 중점적으로 다룰 것이다. 구체적으로는 산화스트레스에 의해 잘려지고 아르기닌화 되는 Arg/N-말단 경로의 기질인 RILP 단백질을 동정하였으며, 이러한 RILP 단백질로 인해 매개된 다낭체 (MVB)-ARL8b-키네신 (kinesin) 단백질 복합체 형성과 이를 통한 MVB의 원형질막(plasma membrane) 타겟팅 기전에 대해 논할 것이다. 뿐만 아니라, ATE1에 의존적으로 일어나는 MVB의 내강소포(intraluminal vesicle)형성 또한 아르기닌/N-말단 경로가 이중 기전을 통해 엑소좀 형성과 수송에 관여하며 궁극적으로 산화 스트레스에 대항한 항상성 조절에 중요하다는 것을 시사한다. 마지막으로, 필자는 본 논문에 대한 요약과 추후 논의를 통해 논문을 마무리하려고 한다. 이 논문에서 다루어진 발견들은 진화적으로 보존된 Arg/N-말단 경로가 포유류 세포에서 산화스트레스에 대항하여 두 가지 모드의 단백질 분해와 엑소좀의 분비를 통해 세포 내 외적 항상성을 조절할 수 있음을 의미한다.

Keywords : 아르기닌/N-말단 법칙, 시스테인/N-말단 법칙, 산화스트레스 센서, 저산소 센서, KCMF1, 엑소사이토시스 Student Number : 2014-25077

Cellular homeostasis requires the adaptation to a dynamically changing environment, which necessitates an equally flexible system that senses and responds to said changes. In the cellular scheme of sensing and adapting to change, the final determinants as executors are proteins. To adapt to various cellular stresses, modifications that deviate proteins apart from the basic function are required. In conjunction with this, cells routinely regulate the levels of proteins via transcriptional upregulation, alteration of protein stability, and post-translational modification that directly correlates to a change in function. In this thesis paper, I will focus on the role of the Cys/N-degron pathway in the cellular response to oxidative stress, focusing on its modulation of both protein stability and post-translational modifications. The N-degron pathway, which is evolutionarily conserved throughout all the kingdoms, states that the exposed N-terminal residue of a protein dictates the stability of a given protein. Amongst the diverse and many branches and sub-pathways of the N-degron pathway, the Cysteine branch of the Arg/N-degron pathway is unique in that it is the only residue capable of being modified by, and thus sensing oxygen atoms. This unique feature naturally imbues the Cys/N-degron pathway a key position to sense and respond to cellular oxidative stress within the N-degron pathway. The first part of this thesis will elaborate on the intra-cellular system designed to maintain a delicate balance of cellular oxidative and reductive power in terms of proteolysis. Mechanistic insights to sense acute-to-prolonged hypoxia with subsequent oxidative stress, and to respond to those stresses via modulation of protein structure, function and metabolic fate dependent on its N-terminally exposed Cys residue will then be presented. Among the possible sources of the N-terminal arginine (Nt-Arg) residue, the two different pre-Arg secondary N-degrons, namely Cys-sulfinic acid (CysO2) and Cys-sulfonic acid (CysO3), bifurcate the metabolic fate of the substrate in question into either the ubiquitin-proteasome system (UPS) or the autophagy-lysosome system (ALS) respectively. This bifurcation is responsible for the crosstalk between the novel N-recognin KCMF1-UBR4 circuit and canonical UBR1/UBR2 circuit, resulting in the repriming of the ubiquitin code. This finding will expand the field of the N-degron pathway by elucidating the identity of second-position N-degron as a functional degradation determinant beyond that of subordination or sequel to the primary Arg/N-degron. Subsequently, the physiological relevance of this oxidative stress-sensing, regarding the linkage between Cys/N-degron circuit and mitochondrial homeostasis will be investigated specifically under oxidative stress. E3 ligase and ubiquitin-dependent autophagic N-recognin KCMF1 will also be compared with the conventional autophagic shuttling adaptor N-recognin p62. The following part of the thesis will broaden the scope to cell-to-cell communication comes in a sequel of stress sensing mechanism and how this inter-cellular signaling is mediated via Arg/N-degron pathway. I will focus on elucidating the mechanism of Arg/N-degron pathway mediated exocytosis. Specifically, RILP, which undergoes oxidative stress-induced cleavage and subsequent arginylation, settles a formation of MVB-ARL8b-kinesin complex formation for multivesicular body transport toward the plasma membrane. Moreover, ATE1 mediated arginylation also regulates the formation of intraluminal vesicles inside MVB. Through these dual regulatory steps of exosome biogenesis and transport, cells can reach intercellular homeostasis against oxidative stress beyond a single cellular level. In the final section of my thesis, I will conclude with an overall summary and discussion of my findings. These series of findings will provide a complete and integrated view of the evolutionarily conserved cysteine branch of the Arg/N-degron pathway for both mammalian intra- and inter-cellular homeostasis against oxidative stress via bimodal proteolysis followed by oxidation and exosome secretion, respectively.

*The first part of the Results section was published in [Heo et al. 2021. The N-terminal Cysteine is a Dual Sensor of Oxygen and Oxidative Stress. Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A., in press] (please refer to CV). **The second part of the Results section is being prepared for submission.

Keywords: Cys/N-degron pathway, Arg/N-degron pathway, oxidative stress sensor, hypoxia sensor, KCMF1, exocytosis

Student ID: 2014-25077