추출 용매에 따른 홍국쌀의 세포독성 평가

Abstract

미생물복귀돌연변이 시험과 같은 in vitro 독성시험의 수행을 위해서는 시험물질을 용매에 용해하여 처리하여야 한다. 대부분의 식품은 용매에 용해되지 않는 형태이기 때문에, 식품의 전체 특성을 반영할 수 있는 in vitro 독성시험법의 고안이 필요한 실정이다. 홍국쌀은 아시아 전반에서 널리 섭취하고 있는 식품이나, 안전성을 확보할 수 없는 다수의 성분을 함유하고 있다. 따라서, 본 연구에서는 홍국쌀의 세포독성 평가를 위한 적절한 추출 용매를 고안하고, 더 나아가 식품의 in vitro 독성시험을 위한 추출 방법을 제안하는 것을 목표로 하였다. 추출 용매로는 모든 화합물의 성질을 최대한 반영할 수 있도록 넓은 범위의 극성을 가지며, 다양한 작용기를 가진 추출 용매 10가지(물, 메탄올, 아세톤, 에탄올, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 톨루엔, 헥세인, 5mM 염산, 0.5mM 수산화나트륨)를 선정하였다. 각 추출물의 세포독성은 마우스의 정상 간 세포주에 처리하여 측정하였으며, 화학적 특성은 고성능 액체 크로마토그래피와 질량 분석기(HPLC-MS)를 이용하여 확인하였다. 추출물을 홍국쌀을 기준으로 세포에 처리하여 세포독성을 계산한 결과, 메탄올 추출물에서 세포독성이 가장 높게 나타났으나, 추출물 질량을 기준으로 세포독성을 산출한 결과, 에탄올, 아세톤, 클로로포름 추출물의 세포독성은 메탄올과 비슷한 수준으로 나타났다. 그 외의 추출물에서는 세포독성이 거의 나타나지 않거나, 무시할 수 있는 수준으로 나타났다. 메탄올 추출물과 메탄올 추출 분획물의 결과를 종합하여 메탄올 추출물에 존재하며 세포독성을 일으킬 수 있는 8개 봉우리를 선택하였으며, 고성능 액체 크로마토그래피와 텐덤 질량분석기(HPLC-MS/MS) 분석을 통해 화합물의 구조를 추론하였다. 구조를 통해 독성을 예측할 수 있는 소프트웨어를 통해 분석한 결과 이들 구조는 독성을 일으킬 가능성이 높으며, 이 중 6개는 유전 독성 및 발암성을 갖는 화합물일 것으로 예측되었다. 추출 수율이 높은 메탄올 추출물에 존재하는 화합물만을 정성하였지만, 메탄올 외의 세포독성이 나타난 추출물에서 관찰된 화합물들 또한 세포독성에 기여할 수 있다. 그러므로, 홍국쌀의 모든 화합물의 독성을 반영하여 세포독성시험을 수행하기 위해서는 메탄올을 포함하여 다른 추출 용매(에탄올, 아세톤, 클로로포름)들과 함께 사용해야 할 것이다. 본 연구 결과를 바탕으로, 홍국쌀이 아닌 다른 식품의 in vitro 독성 시험에의 적용 시에도 추출 용매에 따른 성분 비교를 통해 식품의 독성을 가장 잘 반영할 수 있는 용매의 조합을 선택할 것을 제안한다.

Test substances must be prepared in a proper formulation that can be added to cells or bacteria to conduct in vitro toxicity tests. Most food ingredients are in a form that cannot be diluted in a solvent, and they must be extracted for treatment. In this study, solvents with various functional groups and a wide range of polarities were selected to encompass as many chemical components as possible. Red yeast rice, which has been the subject of safety warnings by several agencies but is widely used in Asia, was chosen as the extraction sample. The toxicity of the extract was evaluated by a cell viability test to mouse liver cells, and the chemical properties were analyzed through HPLC-MS analysis. Since methanol showed the highest extraction yield and cytotoxicity, the structures of eight compounds from methanol extract were proposed by high-resolution LC-MS and MS/MS analysis, and their structures suggest substantial toxicity based on SAR prediction. Ethanol, acetone, and chloroform extract exhibited cytotoxicity comparable to methanol extract, considering the extraction yield and distinct compounds as compared with the methanol extract. In the case of using methanol as the sole solvent, it is difficult to completely determine the cytotoxicity of red yeast rice. Therefore, the optimal extract solvent combination to conduct cytotoxic tests of red yeast rice could be methanol, ethanol, acetone, and chloroform. It is necessary to compare the profiles of compounds according to the various solvents and identify a combination of solvents when applied to in vitro toxicity tests of foods.