Understanding the molecular mechanisms of seed number variation in Arabidopsis and Lepidium

Abstract

밑씨의 수정으로 생성되는 생식기관인 종자는 식물과 인류의 생활에서 떼어낼 수 없는 중요성을 가지고 있다. 종자의 생성은 식물 생활사의 매우 중요한 역할을 하고 있으며, 종자는 인류 역사상 음식, 사료 그리고 연료 등 중요한 자원으로써 사용되어져 왔다. 특히 종자 수는 번식의 성공과 수확량의 영향을 줄 수 있는 중요 형질들 중 하나이다. 그렇기에 종자수를 조절하는 인자의 연구는 중요한 가치를 가지고 있지만, 여전히 미지인 부분들이 남아있다. 본 연구에서는 애기장대에서 열매 당 종자 수 조절인자에 대해 집중을 하였으며, 이를 위해 131개의 애기장대 생태형을 이용하였다. 애기장대의 131 생태형 중 열매 당 종자 수 표현형이 가장 낮은 10개의 생태형은 밑씨 수정률에 영향을 받는다. 열매 당 종자 수 표현형이 가장 높은 10개의 생태형은 밑씨의 형성 수의 영향을 받는다. 이러한 결과들을 통해 본 실험에서 열매 당 종자 수는 밑씨의 수정률과 밑씨의 생성 숫자에 의해 조절되고, 찾고자 하는 조절 유전 인자 또한 밑씨의 수정률과 밑씨의 생성숫자를 조절함으로써 열매 당 종자 수를 조절할 것임을 알 수 가 있다. 애기장대의 131 생태형의 열매 당 종자 수의 GWAS 분석은 열매 당 종자수와 연관이 있는 107 개의 SNP를 나타냈다. 그 중에서 p-value 가 가장 낮은 10개의 SNP를 후보로써 선정했으며 그 후 해당 후보 SNP 주변에 위치하거나 또는 SNP를 포함하고 있는 유전자를 대표 유전자로 선정한다. 선정된 10개의 대표 유전자들의 T-DNA 삽입 돌연변이들의 표현형을 측정하였고, 그 중 AT1G61890, PUP15, AT4G23030, AT4G38710 네 개의 대표 유전자의 T-DNA 삽입 돌연변이의 표현형이 비교용 생태형인 Col-0와 비교했을 시 유의미한 변화를 보여주었다. AT1G61890과 AT4G23030은 MATE 유출 계열(family) 단백질로 T-DNA 삽입 돌연변이에서 둘다 열매 당 종자 수가 증가됬다. PUP15는 푸린 투과효소 구성 계열 중 하나 로 T-DNA 삽입 돌연변이에서 열매 당 종자 수가 증가됬다. AT4G38710은 글리신 풍부 단백질로 T-DNA 삽입 돌연변이에서 열매 당 종자 수가 감소된다. GWAS의 한계점을 극복하기위해 QTL을 수행하기로 하였고, 이를 위해 Col-0와 Di-G를 서로 교배시켰다. 애기장대의 생태형 중 하나인 Di-G가 본 실험 및 다른 실험에서 모두 열매 당 종자 수 및 밑씨 수 가 크게 측정되었다. 이러한 교배가 잘 이뤄졌는지를 확인하기위해 유전자 표식을 제작하여 각 개체의 염기서열을 확인하였고, Col-0, Di-G, 그 둘의 교배종의 염기서열이 서로 다름을 통해 교배가 잘 이뤄졌음을 확인할 수 있었다. 열매 당 종자 수를 같은 종내 말고 종간 에서도 확인하기 위해 비교대상으로 애기장대와 같은 과인 십자화과에 속하며 가까운 유연관계를 가지고 있는 다닥냉이를 선정하였다. 열매당 종자 수에 대해서 다닥냉이는 씨방 당 한 개의 종자가 있는 반면 애기장대는 씨방 당 약 스무개의 종자가 있는 차이점을 보여준다. 이러한 열매 당 종자 수 차이점은 식물의 진화와 연관이 되어있으며 이런 변화에 앞서 발견한 애기장대에서 열매 당 종자 수를 조절하는 유전자가 관련이 있는지를 알아보고자 그 실험의 기초를 세우고자 한다. 그를 위해, 먼저 수집한 다닥냉이의 종이 무엇인지를 ITS 염기서열을 이용해 확인하고자 하였고, NCBI에 있는 다닥냉이 종들의 ITS 염기서열과 수집한 다닥냉이의 ITS 염기서열을 MEGA 11 프로그램을 이용해 비교한 결과, 수집한 다닥냉이의 종이 콩 다닥냉이임을 확인할 수 있었다. 다닥냉이에서 밑씨 생성 시 옥신의 축적 패턴을 확인하기위해 DR5를 형질전환을 수행하였고, 꽃 담그기(floral dippig) 방식을 이용하여 DR5의 형질전환을 시행하였다. 현재 형질전환 된 종자를 구분하는 과정을 진행 중이다. 이번 실험에서, 종내 및 종간 분화에서 열매 당 종자 수 를 조절하는 유전적 메커니즘에 대한 연구를 실시하였다. 종내 연구에서, 나는 열매 당 종자수를 조절하는 유전자들을 GWAS 및 표현형 측정을 통해 찾았으며, GWAS의 한계점을 보완하기 위해 QTL을 이용해 Col-0와 Di-G에서 열매 당 종자 수를 조절하는 유전자를 찾고자 한다. 종간 연구에서는 다닥냉이와 애기장대의 차이점을 해부를 통해 확인하였으며, 다닥냉이의 종을 판별 하고 DR5를 형질전환하여 밑씨 생성 간 옥신패턴을 확인하여 열매 당 종 자 수 와 관련된 연구를 시작하고자 한다. 해당 연구의 결과들은. 유채 등 다른 식물들의 종자 수 연구에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Seeds, the reproductive organs that are the result of ovule fertility, cannot be separated from plant and human life. Seed production is a critical phase in the life history of plants and seeds are used as an essential resource of human history, such as food, feed and fuel. Especially, seed number is one of key traits for the plant fitness and crop yield. Thus, studying the genetic mechanism determining seed number is important, but still many unknown areas are there. In this study, I identified significant variation in seed number per silique among 131 accessions of Arabidopsis thaliana. Ten ecotypes with the lowest number of seeds per silique showed low fertility. Ten ecotypes with the highest number of seeds per silique showed large number of formed ovules. These results suggest that the variation in seed number per silique among 131 accessions is regulated by different fertility and formed ovule number. To identify the genes regulating seed number per silique, Genome-wide Association Study (GWAS) was performed. The analysis characterized 107 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) that are highly correlated with the observed variation in the seed number per silique among 131 accessions. Ten SNPs were selected for candidate genomic loci statistically supported. I further identified the candidate genes that are closely located or include the selected SNPs. Phenotyping T-DNA insertion knockout mutants of the candidate genes revealed that the loss of function of AT1G61890, PUP15, AT4G23030, and AT4G38710 caused significant different seed number per silique values. AT1G61890 and AT4G23030 encode MATE efflux family protein and the two genes decrease the seed number per silique. PUP15 encodes a member of purine permeases family and pup15 mutants displayed increased seed number per silique. Moreover, I further identified increase in the seed number per silique in the knockout mutants of AT4G38710 that encodes glycine-rich protein. To complement the GWAS, I created a genetic population for Quantitative Trait Loci (QTL) analysis by crossing Col-0 with Di-G that showed consistent seed number phenotype between two independent studies. To confirm the crossing of Col-0 and Di-G, I produced genetic markers. The markers displayed different nucleic acid sequence in Col-0, Di-G, and their crossing. These results indicated success of crossing Col-0 and Di-G for QTL genetic population. In addition to the study on the intra-species variation among A. thalina ecotypes, I tried to extend my study to the inter-species variation in seed number per silique between Arabidopsis and Lepidium. Lepidium and Arabidopsis are closely related species in the family Brassicaceae while they displayed distinct patterns of seed production in silique. Lepidium forms one seed per locule while Arabidopsis does around twenty seeds per locule. To identify the collected Lepidium species, ITS part sequence of Lepidium species in NCBI is used. Used ITS primers to get ITS sequence of the collected Lepidium. Afterwards, I performed MEGA 11 software to compare the ITS sequence of the Lepidium samples and Lepidium species in NCBI. In MEGA 11, the ITS sequence of the Lepidium sample and Lepidium species are aligned by ClustalW option then construct phylogenic tree applying neighbor-joining method. The phylogenic tree with 1000 Bootstrap replication, displayed that the Lepidium species is Lepidium virginicum. To characterize the auxin accumulation patterns of Lepidium during ovule formation, I performed DR5 transformation to Lepidium. I used two plasmids pC3300:pDR5-ntdTOMATO and pC3300:pDR5-GUS for agrobacterium transformation. Afterwards, I performed floral dipping to Lepidium. The selection of Lepidium transformation sample is in progress. In this dissertation, I investigated the genetic basis of intra- and inter-species divergence in seed production per silique. In intra-species study, I identified genes regulating seed number per silique through GWAS and phenotyping in A. thaliana. Furthermore, I did cross Di-G and Col-0 for QTL to overcome GWAS disadvantages. In Inter-species study, I dissected Arabidopsis and Lepidium fruits to characterize seed phenotype difference between them. I further identified collected Lepidium species using ITS sequences. In addition, I performed DR5 transformation to Lepidium to characterize auxin accumulation patterns for studying. I expect that my study will increase and yield control of important crop specie, such as Brassica napus.