복제 시기 조절 이상에 의해 유발되는 전사-복제 충돌에 대한 연구

Abstract

전사-복제 충돌(TRCs)은 복제기구와 RNA 중합효소가 S기에 충돌할 때 발생한다. 비록 전사와 복제가 TRCs의 발생을 최소화하기 위해 조절되지만, TRCs는 정상세포에서 필연적으로 발생하며 특히 암세포에서는 더욱 많이 증가한다. 그러므로 S기에 TRCs를 적절하게 해소하는 것은 유전체의 안정성을 유지하는 데 매우 중요하다. 본 연구실의 선행연구에는 RecQL4-Orc4 융합단백질이 발현되는 즉, pre-RC에 RecQL4 단백질을 결합시킨 인간 골육종 세포에서 후기 복제 원점의 복제가 S기 초기에 활성화되어 TRCs일 가능성이 큰 복제 스트레스가 유발되며, 이 복제 스트레스에 대한 세포 반응에 TOPBP1이 필요함을 확인하였다. 본 연구에서는 복제 시기 조절 변화에 의해 발생하는 복제 스트레스가 TRCs인지 확인하기 위해서, 전사 억제제 처리시 복제 스트레스가 감소하는지 여부와 전사기구와 복제기구의 충돌이 실제로 발생하는지를 조사하였다. 그 결과 면역 형광 염색법을 통해 R-loop와 FANCD2의 foci가 전사 억제제 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다. DNA:RNA hybrid 구조를 가지고 있는 R-loop는 RNA 중합효소가 멈춘 곳에 형성되며 FANCD2는 정지된 복제분기점에 결합한다. 또한, 복제기구의 핵심 인자인 PCNA 항체와 RNA 중합효소Ⅱ의 C-말단 인산화 부위 특이적 항체를 사용하여 근접 결합 분석을 진행한 결과, 복제 시기 조절 변화에 의해 PLA foci가 증가하는 것을 확인하였다. 한편 이 때 발생하는 전사-복제 충돌 반응에서 TOPBP1의 역할과 작용 기전을 규명하기 위해서 TOPBP1 BRCT 도메인의 일부가 결실된 다양한 TOPBP1 단백질들을 발현시킨 다음 전사-복제 충돌 반응을 분석하였다. 그 결과, FANCD2 foci를 형성하는 데에는 ATR 활성화 도메인과 BRCT7-8 도메인을 포함하는 TOPBP1의 C말단만 있어도 충분하지만, 전사-복제 충돌에 의해 유발되는 DNA 이중 가닥 절단을 억제하기 위해서는 C말단과 더불어 BRCT3, 6 도메인이 필요함을 확인하였다. TOPBP1과 FANCD2의 상호작용이 TRCs가 발생했을 때 더욱 증가하는 것을 확인했다. 이러한 결과로부터 RecQL4-Orc4 융합단백질을 발현하여 후기 복제 원점의 조기 활성화를 유도한 세포에서 실제로 전사-복제 충돌이 일어나며, ATR 활성화 이외에도 TOPBP1이 직접적으로 관여하는 전사-복제 충돌에 대한 세포 반응 경로가 존재함을 알 수 있다. 또한, 본 연구에서 Doxycycline 처리로 손쉽게 전사-복제 충돌이 유도되는 안정적인 인간 세포주는 향후 인간세포에서 일어나는 TRCs 반응을 연구하는 모델 시스템으로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Transcription-Replication conflicts (TRCs) occur when replication machinery collides with RNA polymerase in S phase. Although transcription and replication are coordinated to minimizes TRCs, TRCs inevitably occur in normal cells and increase significantly in cancer cells. Therefore, proper resolution of TRCs in S phase is critical for the maintenance of genome integrity. In previous studies in this lab, it was confirmed that the late replication origin was activated in early S-phase in human osteosarcoma cancer cells that tethered RecQL4 on the pre-RC by expressing RecQL4-Orc4 fusion protein, leading to replication stress which is likely to TRCs and TOPBP1 was needed in the cell response to this replication stress. In this study, to confirm that the replication stress induced by perturbation of the replication timing control is TRCs, we investigated whether the replication stress is reduced when transcription inhibitor is treated and whether a collision between transcription machinery and replication machinery actually occurs. Immunofluorescence staining analysis showed that foci of R-loop, a loop containing DNA-RNA hybrids produced by stalling of RNA polymerases, and FANCD2, a protein binding to stalled replication fork, were decreased by transcription inhibition. In addition, as a result of using the PLA using an antibody specific to the C-terminal phosphorylation site of RNA polymeraseⅡ and PCNA antibody, which is a key factor in the replication machinery, it was confirmed that PLA foci were increased by perturbation of the replication timing control. Meanwhile, in order to identify the role and mechanism of TOPBP1 in the transcription-replication conflicts response, various TOPBP1 proteins in which some BRCT domains are deleted were expressed and then the TRCs response was analyzed. It was confirmed that only the C-terminus of TOPBP1 containing the ATR activation domain and the BRCT7-8 domain is sufficient to rescue FANCD2 foci, but the BRCT3 and BRCT6 domains as well as the C-terminus are required to reduce DNA double-strand breaks(DSBs) which is induced by TRCs. The interaction of TOPBP1 and FANCD2 was also increased when TRCs occurred. From these results, it was confirmed that TRCs actually occurs in cells in which early activation of late replication origin was induced by expressing RecQL4-Orc4 fusion protein and in addition to ATR activation, there is a cellular response pathway to the transcription-replication conflicts in which TOPBP1 is directly involved. In addition, it is expected that the stable human cell line, in which transcription-replication conflict is easily induced by treatment with Doxycycline in this study, will be usefully utilized as a model system to study the TRCs response in human cells in the future.