The study of neuroprotective effect of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells and herbal compound on amyotrophic lateral sclerosis

Abstract

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive neurodegenerative disease characterized by loss of upper and lower motor neurons and degeneration of neuromuscular junctions in skeletal muscle. Most cases of patients with ALS are sporadic ALS (sALS), while about 5-10% of patients with ALS have a family history and considered as familial ALS (fALS). The main reason of the ALS remains unknown, but several epigenetic studies have found several mutations related with the pathology of the disease. In the fALS, mutation of SOD1 which is function as free radical-scavenging enzyme Cu/Zn superoxide dismutase is wildly studied model of ALS disease. Other known genes of ALS are fused in sarcoma (FUS) gene, TAR DNA-binding protein (TARDBP), and chromosome 9 open reading frame 72 (C9orf72) (Huai & Zhang, 2019; Zou et al., 2017). So far two drugs, Riluzole and Edaravone, have been approved by the U.S Food and Drug Administration (FDA) to cure patients with ALS. Riluzole functions as suppresser of excessive glutamate and Edaravone acts by suppressing oxidative stress. However, they provide limited improvement in survival to ALS patients (Cifra, Mazzone, & Nistri, 2013; Jaiswal, 2019; Miller, Mitchell, & Moore, 2012). Many previous studies have demonstrated several therapeutic methods that have shown positive results in ALS, including gene therapy, chemical therapy and cell therapy. In this study, the aims are to identify therapeutic efficacy of herbal compound (KCHO-1) and human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells (hUCB-MSCs) for improving progression of ALS. The KCHO-1 is a novel mixture of herbal compound that is composed of several traditional medicine and defined as complementary and alternative medicine (CAM). In this study, we identify whether oral delivery of KCHO-1 could improve disease progression and alleviate pathology in an ALS model and found that KCHO-1 effect positive on roatrod score and improve life span of SOD1 transgenic mice. Furthermore, administration of KCHO-1 inhibited reactive oxygen species (ROS) and reduced activation of gp91phox and MAP kinase activity in both microglial cells and SOD1 transgenic mice. These results demonstrate that the KCHO-1 can be a novel therapeutic option for ALS. Among of various cell therapy, stem cell therapy is a favorable therapeutic option and has been emerged as neuroprotective in ALS disease. Furthermore, ALS is a multifactorial disease that affect various parts during disease progression (Baloh, Glass, & Svendsen, 2018; Kjaeldgaard et al., 2018). In this study, we performed administration of hUCB-MSCs in SOD1 transgenic mice repeatedly. Without route for central nervous system (CNS), we performed intramuscular infusion of hUCB-MSCs and found alleviation of pathology on the skeletal muscle of SOD1 transgenic mice. Repeat intramuscular injection of hUCB-MSCs alleviate muscle atrophy and inhibit degeneration of neuromuscular junctions through alleviation of ROS levels. Furthermore, hUCB-MSCs activate AMPK pathway in the skeletal muscle and activated AMPK induce inhibition of the iNOS/NO signaling and upregulation of pretein synsthesis. These results demonstrate that hUCB-MSCs can improve disease progression and can be a therapeutic option and practical route for treatment of ALS. Here we demonstrated that KCHO-1, new herbal compound, exert therapeutic effect against mutant SOD1 G93A mouse model by reducing the oxidative stress through gp91phox and MAPK pathway. Treatment of KCHO-1 also decreased activation of microglia cells depending on various concentration of KCHO-1. Furthermore, intramuscular transplantation of hUCB-MSCs significantly ameliorate muscle atrophy and denervation of ALS mouse model via activation of AMPK pathway. Consequently, we demonstrate that oral delivery of KCHO-1 and administration of hUCB-MSCs through skeletal muscle provide positive effect on ALS pathogenesis and can be promising therapeutic options for the therapy of ALS.

루게릭 질환이라고 알려진 측삭 경화증 (ALS) 은 상위 및 하위 운동성 신경세포가 선택적으로 사멸되는 신경퇴행성 질환으로서 이로 인하여 골격근내의 신경근 접합부가 소실 및 골격근퇴행 등 여러 장기에서 근 위축이 발생하는 질환이다. 대부분의 루게릭 환자의 경우 산발성질환의 특성을 갖고 있으며, 대략 10%의 경우만이 가족성 루게릭 형태를 갖고 있다. 현재까지 루게릭 질환의 주요원인은 밝혀지지 않았지만, 이를 밝히기 위해 다양한 연구들이 진행되고 있으며, 특히 후생유전학 연구를 통하여 루게릭 질환과 연관이 있는 돌연변이 유전자들을 밝혀내고 있다. 그 중 가족성 루게릭 질환과 관련이 있는 활성산소 소거효소인 SOD1 유전자의 돌연변이 루게릭 질환 마우스 모델을 이용한 활발한 연구가 진행되고 있으며 이 외에도 FUS, TARDBP 및 C9orf72 등 루게릭의 원인을 밝히기 위한 다양한 연구가 지속되고 있다. 현재까지 환자 치료를 위해서 Riluzole 과 Edaravone 이 두 개의 약물만이 FDA로부터 승인을 받아 치료용으로 사용되고 있다. Riluzole의 경우 신경세포 내에서 과도한 글루탄산염의 분비를 억제함으로써 치료효과를 보여주고 있으며, Edaravone의 경우 과도한 활성산소를 억제함으로써 치료효과를 보여주고 있다. 하지만 임상결과 이 두 개의 약물을 사용했음에도 불구하고 평균적으로 3개월의 수명연장 효과만을 보여주고 있으며 아직 까지는 극적인 효과를 보이는 치료방법은 밝혀내지 못하고 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해서 많은 연구들이 효과적인 치료제를 개발하기 위해 유전자치료, 화학적 치료 및 세포치료 등 다양한 시도가 진행되고 있다. 본 연구에서는 KCHO-1이라는 대체의학 약물과 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 이용하여 치료효과 및 이러한 치료제가 갖는 새로운 메커니즘을 검증하였다. KCHO-1은 전통적으로 사용해온 여러 가지 약초들의 추출물을 혼합한 약초혼합물이다. KCHO-1의 효과를 검증하기 위해 돌연변이 SOD1 유전자를 보유하고 있는 쥐 모델을 이용하였고, 약 한 달간의 구강투여 결과 운동능력 및 생존기간에서 효과를 볼 수 있었다. 이러한 효과의 메커니즘을 확인하기 위해 루게릭 질환의 대표적인 질환 특성 중 하나인 활성산소의 농도를 확인하였고, 결과적으로 KCHO-1이 NOX2와 MAPK의 발현을 억제함으로써, 소교 세포 및 쥐 모델의 신경계 내에서 활성산소 농도를 줄여준다는 것을 확인할 수 있었다. 현재까지 신경퇴행성 질환을 치료하기 위해 다양한 세포치료가 시도되었다. 그 중에서 줄기세포를 이용한 치료는 가장 선호되는 방법 중 하나이며 기존의 임상실험 결과에서도 루게릭 질환에 신경보호효과가 있는 것이 알려진바 있다. 본 연구에서는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 이용하여 돌연변이 SOD1 쥐 모델에서 효과를 확인하고자 했다. 이를 위해 우리는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 쥐 모델의 골격근에 일주일에 한번씩 주기적으로 이식했다. 결과적으로 이식된 줄기세포는 쥐 모델의 운동능력 및 생존기간을 증가시켰을 뿐만 아니라, 골격근내의 활성산소의 축적을 줄여 줌으로써 골격근 및 신경근 접합부의 소실을 억제 했다. 특히, 이식된 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 골격근내의 AMPK 신호를 활성화 시키고, iNOS 신호를 억제했는데 이는 골격근내의 단백질 합성신호를 촉진시키는 결과를 보여줬다. 이 연구 결과들은 (1) KCHO-1이라는 새로운 대체의학약물이 루게릭 질환 쥐 모델에서 신경계 내의 활성산소의 농도를 억제함으로써 효과가 있음을 확인했고, 이러한 효과가 소교 세포의 활성으로 인해 증가된 NOX2 신호를 억제함으로써 나타난다는 사실을 검증 했다. (2) 또한 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 기존의 신경계 경로가 아닌 골격근을 통한 경로를 통해 이식했을 때, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포가 쥐 모델의 골격근내의 AMPK 활성화 시키고 활성산소의 축적을 억제함으로써, 단백질 생성 촉진 및 iNOS 신호를 억제하여 쥐 모델의 골격근 및 신경근 접합부를 보호한다는 사실을 검증하였다. 결과적으로, 본 연구는 루게릭 질환에 대한 전도유망한 치료전략으로서 대체의학 약물인 KCHO-1 과 골격근 경로를 통한 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 적용 가능성에 대한 근거를 제시한다.