Chromatin remodeling driven by TWIST2 and Class I HDACs regulates the regenerative ability of postnatal fibroblasts

Abstract

포유동물의 피부 진피는 섬유아세포를 주축으로, 면역 세포 및 피부 부속기와 관련된 다양한 세포유형으로 구성되어 있다. 이들 중 진피세포 내에서 가장 많은 비중을 차지하는 세포는 피부 발달과 성숙에 중요한 역할을 하는 섬유아세포이다. 생체 내 조직 줄기세포는 일시적인 세포의 스트레스 상황 및 결손상황에서 조직 재생에 필요하며 보통 일정수준의 휴지 상태로 존재하고 앞선 특수한 상황이 발생했을 때 활성화 된다. 피부에서도 이러한 성체줄기세포의의 활성화가 필요한 상황이 있으며 주로 피부 상처 및 외상 후 회복이나 상처유발신생모낭형성(wound-induced hair follicle neogenesis, WIHN)과정에서 필요하며 이 과정에서 재생능력을 가진 섬유아세포의 활성화가 조직 재생에 전반적으로 기여하게 된다. 신생마우스의 진피 섬유아세포는 출생 후 아주 짧은 시간 동안은 성인줄기세포처럼 진피 모유두 세포 및 섬유아세포로 분화가 가능하지만 수일 내에 이러한 능력을 읽어버리게 된다. 또한 이 세포를 배양하면 시험관 내 미세 환경에 적응하여 본래 가지고 있던 성체줄기세포효능을 유지하기 어렵게 되며 이 과정도 수일 내에 발생하게 된다. 그러나 지금까지 피부진피세포내의 급격한 세포 운명 변화의 근본적인 세포 내 메커니즘은 알려져 있지 않았다. 히스톤 잔기의 아세틸화는 전사 인자(TF)의 접근성을 조절하는 동적 구조변화를 통해 세포의 정체성에 영향을 미쳐 세포의 운명 및 전환 과정에 기여하는 시스템으로 지금까지 다른 조직에서 이러한 히스톤 변형의 동적 변형과 세포의 운명결정과정의 연관성에 대하여 많은 연구가 이루어졌다. 따라서 본 연구에서도 이러한 히스톤 변형을 기반으로 출생 후 진피 세포 가소성의 고유 메커니즘을 조사하게 되었다. 본 논문의 첫번째 부분에서는 출생 후 0일(PD0), 출생 2일(PD2) 및 출생 4일(PD4) 진피 세포의 모낭 형성에 기여하는 세포의 능력이 빠른 시간 동안 감소 하는 것을 확인하였으며 원인을 분석하기 위해 각각의 출생 일별 진피세포들을 단일세포수준에서 RNA 시퀀싱을 실시하였다. 출생 일별 진피세포내의 세포군들의 변화 분석 및 통합된 전사체들의 분석결과, 출생 후 빠른 시간 내에 진피 세포 재생 표적 유전자는 감소한 반면 섬유아세포 성숙 경로 표적 유전자들은 증가된 것을 확인하였다. 이러한 전반적인 전사체들의 변화 원인을 좀 더 분자적 수준에서 깊이 있는 통찰력을 얻고자 진피세포들의 H3K27아세틸화 및 ATAC 시퀀싱을 통해 히스톤 변형 수준 및 오픈 염색질의 영역 변화를 확인했다. 이 결과를 분석하여 이러한 유전자 발현 변화 원인이 PD0와 PD4의 오픈 염색질 영역의 변화에 의한 히스톤의 구조적 변화인 것을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 출생 후 4일(PD4) 마우스에서 HDAC 억제제인 TSA를 주입하였을 때, 히스톤 디아세틸화의 억제로 재생능력이 보존되는 것을 확인하였고 이 과정에서 전사 인자 Twist2가 상위 레벨에서 히스톤 염색질의 구조적 변화에 영향을 미치는 마스터 레귤레이터로 확인되었다. 마지막으로 선별된 전사 인자 Twist2의 조건부 녹아웃 모델에서 피부 진피의 발달지연 확인 및 히스톤 H3K27ac의 상향 조절을 확인함으로써 Twist2가 염색질의 조절인자로서 역할을 하는 것을 확신하는 결과를 얻게 되었다. 본 논문의 두 번째 부분에서는 시험관 내 진피 세포 배양 시 수일 내에 히스톤 아세틸화 수준이 급격히 감소하였고, 이 과정에서 모낭을 형성할 수 있는 효능을 가진 섬유아세포의 능력 또한 상실됨을 확인하였고 관련된 마커 유전자들의 발현도 감소됨을 확인하였다. 세포 배양시 주변미세환경적응에 의한 세포의 재생능력억제를 보존 해주기 위하여 히스톤 디아세틸화를 억제하는 HDAC 억제제들을 선별검사를 통하여 선별 후 class I HDAC 억제제를 시험관배양과정에서 진피 세포에 연속 4일 동안 적용했을 때, 배양 5일(CD5) 진피 세포에서 모낭을 형성할 수 있는 능력이 보존되었고, 이러한 효능이 wnt표적 유전자인 LEF1이 히스톤 아세틸화에 의해 직접적으로 조절됨을 확인하였다. 위 결과들로부터 피부 섬유아세포는 출생 후 신생마우스의 발달 및 시험관 내 세포 확장 동안 역동적인 전사 변화 및 세포의 정체성 변화를 보였으며 이러한 전사체 변화에 히스톤 변형과 그 조절자가 진피 세포 운명 결정에 대한 상위 조절자로서 직접적인 역할을 함을 확인하였다.

The mammalian skin dermis consists of various cell types, including fibroblasts, immune cells, and skin appendage-related cells. Of these, the most common are fibroblasts, which play a major role in skin development and maturation. Tissue stem cells preserve a certain level of potency to maintain and restore tissue integrity. Neonatal dermal fibroblasts in the skin lose stem cell potency after birth and differentiate into dermal papilla cells or mature fibroblasts. Further, cultured postnatal dermal cells rapidly adapt to in vitro microenvironments, making it difficult to maintain stem cell potency; however, the underlying intracellular mechanisms behind this process remain unclear. Chromatin is a dynamic structure that regulates DNA accessibility for transcription factors (TFs) and transcriptional machinery through multiple levels of structural changes, including histone modifications during cell transition or fate commitment. In this study, I investigated the intrinsic mechanisms of postnatal dermal cell plasticity based on histone modifications. The papillary fibroblasts that reside in the skin dermis are the primary cell source for the dermal regeneration pathway, but they lose their regenerative potential within a few days after birth, suggesting integrated transcriptomic changes in dermal cells. Single-cell RNA sequencing of papillary fibroblasts showed that regenerative signature genes decreased during postnatal development, whereas fibroblast maturation pathway target genes increased. Further analyses of H3K27ac and ATAC sequencing, which reflect the level of histone modification and the region of open chromatin, revealed that chromatin accessibility affects the transcriptional changes in dermal cells during skin development. Consistent with these findings, the pan HDAC inhibitor, TSA injected PD4 mice showed preserved regenerative potential of papillary fibroblasts by inhibition of deacetylation. Chromatin analyses in postnatal mice and TSA injected PD4 mice detected motifs of the TWIST2 TF family as the top candidates for master regulators. In addition, histone H3K27ac levels were found to be maintained at high levels in the conditional Twist2 knockout model in postnatal days, which strongly suggests that Twist2 is an upstream chromatin regulator during postnatal maturation in papillary fibroblasts. The histone H3 acetylation level and expression of the target genes of the Wnt signaling pathway rapidly decreased in postnatal fibroblasts during in vitro culture. Accompanied by these changes, dermal cells also lost their hair regenerative ability during the culture period. However, when a class I HDAC inhibitor was applied to dermal cells for four consecutive days, its inductivity was preserved on culture day 5 (CD5). The ChIP assay for LEF1 suggested that H3 acetylation directly regulates LEF1, a main target gene of Wnt. Herein, skin fibroblasts showed dynamic transcriptional changes during early periods of postnatal maturation and in vitro cell expansion. Histone modification and its regulator orchestrate as an upstream regulator, influencing the transcriptional expression on dermal cell fate determination.