파킨슨병에서 TNF-α에 의한 알파-시뉴클린 응집체의 세포간 전이 조절 연구 및 알파-시뉴클린 응집체를 타겟으로 하는 면역 치료법 연구

Abstract

Cell-to-cell propagation of α-synuclein has been proposed to be the underlying mechanism of progression of Parkinson's disease (PD) . Previous studies have provided evidence for cell-to-cell propagation of α-synuclein in cell lines, primary neurons, and animal model. α-synuclein can be taken up by neurons, undergone transport along axons, and finally transferred to another neuron. The previous studies showed that α-synuclein aggregates spread via exocytosis and subsequent endocytosis, while another suggested that tunneling nanotubes were involved in the process. Injection of pre-formed α-synuclein fibrils into the striatum caused brain-wide spread of α-synuclein aggregates and induces dopaminergic neuronal death in the substantia nigra . According to recent studies, inflammation appears to play the critical role in the propagation of α-synuclein aggregates. However, the mechanism by which inflammation regulates propagation of α-synuclein aggregate is unknown. In this thesis, I explain how an inflammatory factor, TNF-α, regulates propagation of α-synuclein aggregates and show the potential for an immunotherapy targeting α-synuclein aggregates. In chapter 1 of this thesis, I explained the background needed for the study. In chapter 2, using in vitro cultures, I discovered that soluble factors produced by activated microglia increased cell-to-cell propagation of α-synuclein, and that TNF-α has the most powerful stimulatory effect among these soluble factors. TNF-α treatment to neurons activated senescence-associated genes, as evidenced by transcriptome studies and immunoanalysis of senescent phenotypic marker proteins. Furthermore, neurons treated with TNF-α secreted more α-synuclein than control through the senescence-associated secretory phenotype (SASP). I have shown that the SASP was mediated by lysosomal exocytosis by using vacuolin-1, a lysosomal exocytosis inhibitor, and RNAi against rab27a. The presence of α-synuclein aggregates in electron-dense lysosome-like compartments was confirmed by using correlative light and electron microscopy as well as immunoelectron microscopy. This indicates that the secretion of α-synuclein through SASP is mediated lysosomal exocytosis. Thus, TNF-α is the primary inflammatory factor that drives cell-to-cell propagation of α-synuclein by boosting SASP and subsequent α-synuclein release. In chapter 3, I developed antibodies targeting α-synuclein aggregates, since extracellular α-synuclein aggregates, which have been regarded as the culprits that drive disease progression in Parkinsons disease. These antibodies not only prevented the cell-to-cell propagation of α-synuclein by capturing the extracellular α-synuclein aggregates but also promoted phagocytosis of extracellular α-synuclein aggregates in microglia. Additionally, passive immunization with aggregate-specific antibodies greatly improved neuropathological phenotypes, such as synuclein aggregation, gliosis, inflammation, and neuronal death in α-synuclein transgenic mouse model. Finally, I conclude this thesis with an overall summary and discussion of my findings in chapter 4. From these findings, I propose the mechanism of α-synuclein propagation and gain insights into the development of immunotherapy that could slow the progression of PD pathogenesis.

최근 연구에 의하면 파킨슨병의 진행을 설명하는 주요 기전은 알파-시뉴클린 응집체의 세포간 전파이며, 다양한 세포주, primary 세포, 동물모델에서 알파-시뉴클린의 세포간 전파에 대한 증거가 보고되었다. 알파-시뉴클린 응집체는 신경세포에 의해 흡수되고 축삭을 통해 이동하여 다른 신경세포로 전파된다고 알려져 있다. 이전 연구에서 알파-시뉴클린 응집체는 세포 외 이입을 통해 유입되고 세포 외 방출을 통하여 인접 세포로 전파될 수 있다고 보고되었다. 또 다른 연구는 알파-시뉴클린의 세포 간 전파를 터널링 나노튜브로 설명한다. 이뿐만 아니라 설치류 및 비인간 영장류에서 미리 형성된 알파-시뉴클린 파이브릴의 선조체에 주입하였을 때 뇌전역으로 알파-시뉴클린의 응집이 확인되었으며, 흑질 지역의 도파민성 신경세포의 사멸이 유도되는 것을 확인하였다. 최근 연구에 따르면 염증반응이 단백질 응집체의 전파에 중요한 역할을 한다고 알려져 왔다. 그러나 아직 염증반응이 어떻게 단백질 응집체 전파를 조절하는지에 대한 메커니즘 규명은 명확하지 않은 상태이다. 본 논문에서는 염증인자인 TNF-α가 알파-시뉴클린 응집체의 전파를 조절하는 기전에 대하여 규명하였고, 나아가 알파-시뉴클린 응집체를 타겟으로 하는 면역 치료법을 제시하였다. 본 논문의 1장에서는 전체적인 연구에 필요한 배경지식을 설명하였고, 2장에서는 in vitro 실험을 통하여 활성화된 미세아교세포에서 생성되는 가용성 인자들이 알파-시뉴클린의 세포간 전파를 증가시킨다는 것을 확인하였다. 그 중에서 TNF-α가 가장 두드러진 효과를 보여 TNF-α를 신경세포에 직접 처리하여 변화를 확인하였다. RNAseq분석을 통해 노화 관련 유전자의 활성을 확인하였으며, 면역 분석을 통하여 노화 관련 특징들이 나타나는 것을 확인하였다. 이뿐만 아니라 라이소좀 세포 외 배출 억제제인 vacuolin-1과 rab27a에 대한 RANi를 사용하여 알파-시뉴클린의 분비가 라이소좀 세포 외 배출 경로를 통하여 이루어짐을 확인했다. 이는 SASP (Senescence-Associated Secretory Phenotype)의 분비가 라이소좀 세포 외 배출에 의해 매개된다는 것을 의미한다. 이러한 사실은 면역전자현미경과 CLEM (Correlative Light, Electron Microscopy)을 통해 알파-시뉴클린의 응집체가 라이소좀에 존재한다는 것을 한 번 더 확인하였다. 즉 TNF-α는 세포노화를 유도하고, 라이소좀 세포 외 배출을 통한 SASP 경로를 통하여 알파-시뉴클린 응집체의 분비 및 전파를 증가시킴을 확인하였다. 3장에서는 이렇게 분비된 알파-시뉴클린 응집체의 전파가 파킨슨병 병리현상에 관련 있다는 점에 착안하여 알파-시뉴클린 응집체를 타겟으로 하는 항체를 개발하였다. 개발된 항체는 세포간 응집체의 전파를 막을 뿐 아니라, 미세아교세포의 알파-시뉴클린의 식균작용을 촉진하였다. 또 항체의 효과는 in vitro 뿐만 아니라 in vivo 실험인 알파-시뉴클린 형질전환 마우스 실험에서도 다양한 병리 현상에 대해 효과가 있음이 확인되었다. 마지막으로, 4장에서는 본 학위논문의 전반적인 요약과 고찰을 하였다. 본 논문의 결과를 통해 알파-시뉴클린의 전파조절 기전을 이해할 수 있었고, 이를 활용하여 파킨슨병 진행을 늦추는 면역 치료법 개발을 위한 통찰을 얻을 수 있었다.