PI3Kγδ inhibitor plus radiation reinforces the antitumor immune effect of PD-1 blockade in syngenic and humanized triple-negative breast cancer model

Abstract

Introduction: The poor response of breast cancer to immune checkpoint blockade may result from low immunogenicity and the immune-suppressive tumor microenvironment. We hypothesized that combined use of phosphoinositide 3-kinase (PI3K) inhibitor to obstruct immune suppression and radiation therapy (RT) as a in situ tumor vaccination would reinforce the antitumor immune effect of PD-1 blockade as an immune checkpoint blockade. Methods: Murine breast cancer cells (4T1) were grown in both immune-competent and immune-deficient BALB/c mice, and tumors were irradiated by 3 fractions of 24 Gy. A PD-1 blockade and a PI3Kγδ inhibitor were then administered every other day for 2 weeks. Flow cytometry analysis and immunohistochemistry served to monitor subsequent changes in immune cell population. Same experiments were performed in humanized patient-derived breast cancer xenograft (Hu-PDX) model, and its RNA of tumor was sequenced to identify immune-related pathways and to profile infiltrated immune cells. Transcriptomic and clinical data were acquired from The Cancer Genome Atlas (TCGA) pan-cancer cohort, and the deconvolution algorithm was used to profile immune cell repertoire. Results: The triple combination of RT, PD-1 blockade, and PI3Kγδ inhibitor significantly delayed tumor growth, boosted the abscopal effect, and improved animal survival. RT significantly increased CD8+ cytotoxic T-cell fractions, immune-suppressive Tregs, MDSCs, and M2 tumor associated macrophages (TAMs). However, PI3Kγδ inhibitor significantly lowered proportions of Tregs, MDSCs, and M2 TAMs, achieving dramatic gains in splenic, nodal, and tumor CD8+ T-cell populations after triple combination therapy. In a humanized PDX model, triple combination therapy significantly delayed tumor growth and decreased immune suppressive pathways. In TCGA cohort, high Treg/CD8+ T cell and M2/M1 TAM ratios were associated with poor overall patient survival. Conclusion: These findings indicate PI3Kγδ are clinically relevant targets in an immunosuppressive TME. And combining RT and PD-1 blockade may overcome the therapeutic resistance of immunologically cold tumors such as breast cancer having immunosuppressive tumor microenvironment.

유방암은 면역원성이 부족하고, 면역억제성 종양미세환경을 가지고 있기 때문에 면역관문억제제에 대해 치료 저항성이 있다고 알려져 있다. 따라서 본 연구는 면역 억제를 방해하는 포스포이노시타이드 3-인산화효소 (phosphoinositide 3-kinase, PI3K) 저해제와 in situ 종양백신 효과를 유도하는 방사선치료 병용치료를 통한 PD-1억제제의 항종양면역효과를 극대화하고자 하였다. 면역세포를 온전히 가지고 있는 일반생쥐(BALB/c) 및 면역이 결핍된 생쥐(Nude)에서 유방암 세포주를 각각 성장시키고, 총 24 Gy 용량의 방사선을 3회로 나누어 성장된 종양에 조사하였다. 그리고 PD-1억제제와 PI3Kγδ저해제를 이틀에 한 번씩, 2주 동안 투여하였다. 종양 및 비장, 림프절을 추출하고 유세포분석 및 면역세포화학법을 이용하여 각 조직의 면역세포의 군집을 관찰하였다. 동일한 실험 일정으로 환자유래 인간화마우스 (humanized patient-derived breast cancer xenograft, PDX) 모델에서 수행하였고, 실험 종료 후 종양조직에서 RNA를 추출하여 전사체분석을 통해 면역세포의 profile과 면역관련 pathways를 관찰하였다. 또한 Cancer Genome Atlas (TCGA) pan-cancer 코호트에서 전체사 및 임상적 자료를 수집하였고, deconvolution 알고리즘을 사용하여 면역세포의 repertoire를 확인하였다. 그 결과, PI3Kγδ저해제 및 방사선치료, PD-1억제제를 삼중병용치료한 군에서 종양의 성장이 유의미하게 지연되었다. 또한 방사선의 abscopal 효과가 증진되었고 생존률이 증가하였다. 단독 방사선치료는 CD8+ T세포의 군집을 유의미하게 증가시켰지만, 동시에 조절T세포(regulatory T cells, Tregs)와 골수유래 면역억제세포(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs) 및 M2 종양관련대식세포(tumor associated macrophages, TAMs)와 같은 면역억제성 세포의 군집 또한 함께 증가시켰다. PI3Kγδ저해제를 투여하였을 때에는 이러한 면역억제성 세포를 효과적으로 저해할 수 있었고 특히 삼중병용치료를 시행한 결과 종양, 비장 및 림프절에 존재하는 CD8+ T세포 군집이 극적으로 증가하였다. 그리고 환자유래 인간화마우스 모델에서도 삼중병용치료가 종양성장의 지연시키고 면역억제성 pathways를 저해시킴을 확인하였다. 마지막으로 TCGA 코호트에서 Treg/CD8+ T세포 및 M2/M1 TAM의 높은 분율과 환자의 낮은 생존률의 유의미한 연관성이 있음을 밝혔다. 이에 본 연구는 면역억제성 종양미세환경에서 PI3Kγδ저해제가 임상적으로 유의미한 타겟이라는 것과 방사선과 PD-1억제제의 병용은 면역억제성 종양 미세환경을 가진 유방암과 같은 면역적으로 cold한 종양의 치료 저항성을 극복할 수 있다는 가능성을 시사한다.