Automated cell sorting for spatial omics

Abstract

Spatial omics profiling technologies have been recognized recently for its ability to decipher the genetic molecules that are structurally relevant in pathology. Especially, in tumor biology, tumor is not the group of malignant tumor cells, but rather group of various cells such as tumor cells, immune cells, fibroblasts, etc. gathers together, constructing the tumor microenvironments. Technologies to analyze such microstructures have evolved from bulk sequencing, single cell sequencing to spatial omics profiling technologies. Spatial omics profiling technologies have highly influenced in decoding cancerous mechanisms by questioning the tumor heterogeneity, tumor microenvironment and spatial biomarkers. Most of the spatial omics technologies focus on mapping the spatial omics landscape in a large scale. They rather introduces the spatially-barcoded capture probes or fluorescence labeled target probes to spatially locate the genetic molecules. The information depth and the scalability of the techniques varies according to the purpose of the spatial assay techniques. Such technologies are capable of discovering the spatial heterogeneity and the spatial landscape of the consisting cell types due to relatively low depth of the omics information. To effectively address the target molecules for therapeutics or diagnostics, higher depth of the omics information are required. To meet the needs, region of interest (ROI)-based spatial technologies isolated the target regions and applies chemistries for higher coverage omics data. Conventional cell sorters utilizes microfluidic channels to sort cells of interest which requires cell dissociation in a solution phase. For instance, Fluorescence activated cell sorter (FACS) or Magnetic-activated cell sorting (MACS) uses fluorescence or magnetic particles, respectively, to designate the cells of interest in dissociated cell solutions. Spatially isolating techniques such as laser capture microdissection (LCM) is able to sort out the ROIs while preserving the spatial context, but it approximately takes an hour for isolating the targets. Also, it uses rather UV laser to dissect out cells or IR-activated melting of polymers to stick out cells which might cause damage to cells. Here, I developed the automated spatially resolved laser activated cell sorter that isolates the cells in target per second while preserving the spatial context of the cells. Specific region of indium tin oxide (ITO) coated slide glass evaporates when illuminated by IR laser pulse, plunging the cells into the desired reservoir. The applicability of the suggested cell sorter are demonstrated in omics profiling chemistries such as DNA sequencing, RNA sequencing, mass spectrometry, etc.

종양은 종양세포만이 원인이 되는 질병이 아닌, 면역세포와 혈관 구조, 표피 세포 등 다양한 세포들이 공동체를 이뤄 질병을 발전시키는 복합적인 질병이다. 이를 분석하기 위하여 차세대 시퀀싱 (NGS), 단일 세포 분석, 유세포 분석 등 다양한 기술이 활용되어 왔다. 특히 RNA sequencing 을 포함한 단일 세포 분석은 종양 내에서 성장, 전이, 진화, 약물의 내성과 관련된 타겟을 발굴하고 이를 조절할 수 있는 인자들을 개발하는 등 종양 연구의 혁신을 이끌었다. 그러나 이러한 접근 방법은 종양 미세 환경 내에서 세포가 존재하고 있는 위치 정보가 손실 되기 때문에 종양의 온전한 그림을 제공하지 못한다. 최근에는 종양 내 이형적으로 분포하고 있는 유전 물질들을 이해하면 종양의 이형성과 종양 미세환경의 탐구와 암의 진화 및 발전 메커니즘을 이해하여 이전에는 발견하지 못한 새로운 제약, 진단 타겟을 발굴 할 수 있을 것이라는 관점들이 제시되고 있다. 다중의 형광 프로브를 활용한 방식으로 DNA, RNA, 단백질 등의 위치를 표적하여 종양의 전체적인 그림을 파악하는 기술들이 최근 폭발적으로 개발되고 있고, 현장 바코딩 방식으로 위치 별로 발현하고 있는 유전 물질을 표적하여 정량화 할 수 있는 방법도 상용화 되어 종양 에서 새로운 발견을 이끌어내고 있다. 그러나 위의 제시된 기술들 모두 De novo로 새로운 제약 진단 타겟을 발굴하는 데에는 한계가 존재한다. 본 논문에서는 공간 오믹스를 가능하게 하는 세포 분리 분석기를 개발하여 관심영역의 세포를 분리하고 이후 DNA, RNA, 단백질 등을 분석하는 어세이들과 연결하여 위치정보를 포함하면서도 높은 정보량으로 세포를 분석하고, 이전까지 발굴하지 못하였던 새로운 진단 제약 타겟을 탐색할 수 있는 기술에 대하여 설명한다. 레이저를 조사하면 희생층이 승화되며 조사 영역에 위치한 세포들을 회수할 수 있고, 현존하는 생화학 어세이를 수행 할 수 있다. 자동으로 이미지 프로세싱을 통하여 원하는 세포들을 특정할 수 있는 프로그램을 개발하였고, 이를 세포주와 임상 샘플에 적용하고 이후 생화학 어세이 적용을 입증하였다. 항원 항체 반응을 이용한 염색 방법 이외에도 높은 정보량으로 유전체 지도를 그리는 염색법 등 다양한 염색 이미지에 적용했으며 본 기술을 활용하여 향후 응용할 수 있는 연구를 제안하였다.