Development of Immunoassays using Novel Antibodies for Rapid Detection of Antibiotic-Resistant and Susceptible Pathogens

Abstract

Staphylococcus aureus (S. aureus) and Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) are major pathogens frequently detected in food and beverage poisoning, and persistent infections. Therefore, the development of a rapid method that can detect these pathogens before serious multiplication is required. In this study, I produced recombinant antibodies against S. aureus and P. aeruginosa from mammalian cells with high yield and purity. Then I developed four different detecting methods and compared those assay times and sensitivities. First, I performed enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using these recombinant antibodies. High binding affinity and low detection limit in both indirect and sandwich ELISAs were obtained to detect methicillin-resistant S. aureus and imipenem-resistant P. aeruginosa. Afterward, I developed a rapid ELISA to decrease the assay time of the conventional ELISA. By optimizing the assay conditions, I reduced the antigen immobilization time from 16 h to 2 h and the primary antibody reaction time from 1 h to 10 min. Next, I developed a novel fluorescence-linked immunosorbent assay (FLISA)-based S. aureus detection method using fluorescent anti-S. aureus antibody. I optimized the FLISA system to reduce the working time in comparison to the conventional ELISA system as well as the rapid ELISA system, resulting in the total assay time of 10 h. Moreover, I established a flow cytometry (FCM)-based detection method that allows rapid acquisition of cell populations in fluid samples by using a fluorescent antibody against S. aureus. Using this method, I detected S. aureus with a 103-105 CFU order of limit of detection value within 1 h. Notably, I represented the efficacy of these four assay methods, ELISA, Rapid ELISA, FLISA, and FCM for detecting S. aureus using clinically isolated MRSA samples. As a result, FCM showed the shortest whole clinical sample detecting time, 4 h including pathogen preincubation. These results indicate that the detecting system using recombinant antibodies-produced herein can be used for the accurate and rapid detection of S. aureus, with a wide range of applications in medical diagnosis, food safety, and drug discovery.

황색포도상구균 및 녹농균은 대표적인 식중독 원인균으로 증식전에 신속히 검출할 수 있는 방법의 개발이 필요하다. 본 연구에서는 황색포도상구균과 녹농균 각각을 인식하는 재조합 항체를 동물세포를 사용하여 고수율 및 고순도로 생산하였다. 이 항체를 사용하여 식중독균을 검출 가능한 네가지 분석법 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), Rapid ELISA, FLISA (Fluorescent-linked immunosorbent assay), FCM (Flow cytometry)을 개발하였고 분석 시간과 민감도를 비교하였다. 먼저, 항생제 내성 황색포도상구균과 녹농균을 검출하기 위해 간접 ELISA 및 샌드위치 ELISA를 수행한 결과, 양쪽 검출법에서 높은 결합성과 낮은 검출한계 값을 확보하였다. 간접 ELISA의 경우 메티실린 내성 황색포도상구균에 대한 EC50 값과 최소 검출 농도는 각각 2.3 ± 0.09 x 104 CFU 및 3.6 x 102 CFU였으며, 샌드위치 ELISA의 경우 각각 5.8 ± 1.91 x 106 CFU 및 4.8 x 104 CFU였다. 그 후 기존 ELISA의 분석 시간을 단축하기 위해 Rapid ELISA법을 확립하였다. 분석 조건을 최적화하여 항원 고정 시간을 16시간에서 2시간으로, 1차 항체 반응 시간을 1시간에서 10분으로 단축하여, ELISA에서 소요되었던 25시간의 총 분석시간을 10시간으로 단축하였다. 그 다음으로 형광 항 황색포도상구균 항체를 이용한 새로운 FLISA 기반 황색포도상구균 검출 방법을 개발하였다. FLISA 시스템을 최적화하여 기존 ELISA 시스템 뿐만 아니라 신속 ELISA 시스템에 비해 작업 시간을 5시간으로 단축하였다. 그리고 황색포도상구균에 대한 형광 항체를 사용하여 FCM 기반 검출 방법을 확립하였다. 이 방법을 통해 최소 103-105 CFU의 황색포도상구균을 1시간 이내에 검출 가능함을 알 수 있었다. 특히, 임상적으로 분리된 메티실린 항생제 내성 황색포도상구균 샘플을 사용하여 황색포도상구균을 검출하기 위한 ELISA, Rapid ELISA, FLISA 및 FCM 분석법의 효율을 비교 검증하였다. 그 결과, FCM을 통해 병원체 전처리를 포함하여 임상샘플을 검출을 총 3.8 h ± 0.5 시간 안에 완료할 수 있었고, 이는 ELISA (25 ± 0.8 시간), Rapid ELISA (10.1 ± 0.8 시간), FLISA (10.3 ± 0.8 시간)보다 신속한 검출이 가능함을 제시하였다. 이러한 결과는 본 연구에서 생산한 재조합 항체를 이용한 검출 시스템이 병원균을 정확하고 신속하게 검출하여 의학적 진단, 식품 안전 및 신약 개발에 광범위하게 응용될 수 있음을 시사하였다.