Regulation of viability and differentiation of human stem cells via size-controlled graphene oxide flakes

Abstract

There is increasing interest in studying stem cell differentiation through cellular physical stimulation which can be translated into cell-recognized tension. It has been known that physical stimulation can direct human mesenchymal stem cell differentiation which called mechanotransduction. Recently, graphene oxide (GO), major derivative of graphene, has been synthesized as promising material which has suitable physico-chemical characteristics for stem cell lineage specification. GO can interact with integrin, the transmembrane receptor protein, through electrostatic, hydrophobic interactions. However, GO used in previous stem cell research has used GO with an irregular morphology and size. Such irregularity of GO causes diverse cellular responses according to lateral sizes of GO. In this study, we fabricated graphite mechanically with narrow size distribution by adjusting the ball-milling time. Then, size-controlled GO flakes were chemically synthesized from ball-milled graphite using modified Hummers method. Size distribution of GO were measured by hydrodynamic situations. Dose-dependent cytotoxicity of the size-controlled GO flakes on human stem cells was observed. The interaction between GO flakes and cells was analysed with electron microscopy. Also, effect of GO with osteogenic and neural differentiation of hMSCs were measured by staining and gene expression level. Also, by analyzing the shape and size of the cells through immunostaining, we confirmed that focal adhesion was key component involved in promoting stem cell differentiation and enhanced cell viability in apoptotic circumstances. We suggest that the size-controlled GO sheets would be efficient candidate for enhancement of lineage determination of human stem cells and therapeutic applications.

세포 인식 장력으로 번역될 수 있는 세포 물리적 자극을 통한 줄기 세포 분화 연구에 대한 관심이 증가하고 있다. 물리적 자극은 기계적 형질도입(mechanotransduction)이라고 하는 인간 중간엽줄기세포 분화를 조절할 수 있는 것으로 알려져 있다. 최근 그래핀의 주요 유도체인 산화 그래핀이 줄기세포 계통 사양에 적합한 물리화학적 특성을 갖는 유망한 물질로 주목되고 있다. 산화 그래핀은 정전기적 소수성 상호작용을 통해 막횡단 수용체 단백질인 인테그린과 상호작용할 수 있다. 그러나 기존 줄기세포 연구에서 사용된 물질은 형태와 크기가 불규칙한 산화 그래핀을 사용하고 있다. 이러한 산화 그래핀 물성의 불규칙성은 산화 그래핀의 측면 크기에 따라 통제되기 어려운 다양한 세포 반응을 일으킨다. 이 연구에서는 볼 밀링 시간을 조정하여 좁은 크기 분포를 가진 흑연을 기계적으로 제작하였다. 그런 다음 수정된 Hummers의 방법을 사용하여 볼 밀링된 흑연에서 크기가 제어된 산화 그래핀 플레이크를 화학적으로 합성하였다. 합성된 산화 그래핀의 크기 분포는 수용액 환경에서 측정되었다. 인간 줄기 세포에서 크기 조절된 산화 그래핀 플레이크의 용량 의존적 세포독성이 관찰되었다. 산화 그래핀 플레이크와 세포 사이의 상호 작용은 전자현미경 분석되었고 인간 중간엽줄기세포의 골형성 및 신경 분화와 함께 산화 그래핀의 효과를 분석하기 위해 염색 및 유전자 발현을 측정하였다. 또한 면역염색을 통해 세포의 모양과 크기를 분석함으로써 국소적 접착이 줄기세포 분화 촉진과 세포자멸사 촉진 환경에서 세포 생존력 향상에 관여하는 핵심 요소이며 이는 세포 종류와 배양 환경에 따라 다른 크기의 산화 그래핀이 효율적임을 확인하였다. 이로서 크기 조절 산화 그래핀 플레이크가 인간 줄기 세포의 분화 계통 결정 및 치료적 응용을 위한 효율적인 후보가 될 것이라고 제안한다.