A colorimetric assay with bi-functional AuNP based on aptamer: On-site detection of Escherichia coli O157:H7 in coconut water

Abstract

In this study, we developed a colorimetric assay with bi-functional gold nanoparticle (AuNP) based on aptamer for sensitive detection of Escherichia coli O157:H7 using the aggregation of AuNP linked with a complementary DNA aptamer specific to E. coli O157:H7 aptamer. AuNP was used as a colorimetric linker and probe, respectively, and E. coli O157:H7 aptamer and its complementary DNA sequences were modified on each AuNP surface. AuNP labeled with E. coli O157:H7 aptamer was used as a bi-functional linker (BL) in a colorimetric competitive assay. Colorimetric assay with BL based on aptamer detected target bacteria by sequential competitive binding between colorimetric probes, which are AuNP having complementary sequences of E. coli O157:H7 (AA, Aggregation Assistant) and E. coli O157:H7 aptamer. In addition, under optimized conditions by main testing parameters, the assay exhibited a detection range of 101 to 106 CFU/400 µL and a detection limit of 57 ± 0.5 CFU/400 µL. In addition, the developed colorimetric assay with BL based on aptamer was excellently evaluated as an on/off detection system in coconut water, a real matrix. Thus, the proposed colorimetric competitive assay with BL based on aptamer can be a proper on-site detection method of foodborne pathogens. In addition, this study provides the basis for research into developing different colorimetric assay with aptamer for pathogen analysis in real matrices. This colorimetric assay with BL based on aptamer functions by driving the system between two competitive interaction dynamics: A) affinity between the aptamer sequence and the target, and B) affinity between the aptamer and the its complementary DNA aptamer.

이 연구에서 우리는 E. coli O157에 특이적인 압타머와 상보적 DNA 압타머가 결합된 AuNP의 응집에 기초하여 E. coli O157:H7의 현장에서 신속하며 민감하게 검출할 수 있는, 압타머가 결합된 이중 기능링커 AuNP를 이용한 비색 검출법을 개발하였다. 이 시스템에서 AuNP는 이중기능링커 및 응집보조 프로브로 사용되었으며, 각 AuNP 표면은 E. coli O157:H7 대상 압타머와 상보적인 DNA 서열의 압타머로 결합되었으며, 이는 각각 이중기능링커 AuNP (BL)와 응집보조 프로브 AuNP (AA)로 명명하였다. BL은 대상균이 존재하지 않을 때에는 상보적인 서열에 의해 AA와 결합하였으며, 양적균형에 의해 특정영역(REVC, 120 – 220 μL)에서 응집 및 침전이 일어났다. 하지만, 대상균이 투입되었을 때에는 경쟁적 결합 우선순위에 의해 상보적 서열의 AA가 아니라 대상균인 E. coli O157:H7과 결합하게 된다. 이는 기존의 양적균형에서의 차이를 일으키게 되고 대조군과 유사한 응집 및 침전이 일어나기 위해서는 기존보다 더 많은 양의 BL이 반응에 참여하여야 한다. 이를 통해 대조군과 대상균 간에는 REVC 영역의 변화가 발생하게 되며, 이를 통해 대상균의 유무를 확인할 수 있었다. 검출은 가장 민감하며 구분되는 BL 영역인 100, 120, 140 μL에서 진행되었으며, 최적화된 조건에서 101 ~ 106 CFU/400 μL의 검출 범위와 57 ± 0.5 CFU/400 L의 검출 한계를 나타냈다. 또한 압타머 기반의 BL을 이용한 비색분석법은 실제 매트릭스인 코코넛워터에서도 on/off 감지 시스템으로 매우 우수하게 평가되었다. 따라서 제안된 압타머 기반의 BL을 이용한 비색분석법은 식중독을 일으키는 병원체를 현장에서 검출하는 데 적합한 방법이 될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 연구를 통해 실제 매트릭스에서 병원균 분석을 위한 앱타머 기반 비색 분석 개발에 대한 향후 연구의 기반을 제공할 수 있었다. 이 압타머 기반 비색 분석법은 A) 압타머 서열과 표적 사이의 친화성, B) 압타머와 그 상보적인 DNA 압타머 사이의 친화력이라는 두 가지 경쟁적인 상호 작용 역학에 의해 구동되었다.