Characterization of Bacteriophages and Their Application as a Phage Cocktail for Biocontrol of Multidrug-resistant Escherichia coli

Abstract

다제내성 세균은 전세계적으로 증가하고 있으며 새로운 치료제의 개발이 요구된다. 대장균은 그람 음성균의 하나로서 다양한 질병의 원인이 되며, 다양한 국가에서 다제내성 대장균의 출현이 보고되고 있다. 박테리오파지(파지)는 항생제의 유망한 대안으로 고려되며, 파지 칵테일은 파지 처리 중 숙주 범위를 넓히기 위해 주로 이용된다. 본 연구에서는 다양한 다제내성 대장균 임상 균주들을 제어할 수 있는 파지들을 분리하였다. 파지들의 생화학 및 유전학적 특성 분석을 진행하였고, 넓은 숙주 범위 기반의 파지 칵테일을 이용하여 여러 조건에서 감염 효과를 평가했다. 다양한 종류의 항생제에 내성을 갖는 총 21주의 다제내성 대장균 임상 분리 균주들이 본 연구에서 이용되었다. 그 결과, 총 여섯 개의 대장균 파지들을 분리하였다. 파지의 숙주 범위 평가를 통해 ELSA1, ELSA2, 그리고 ELT4로 구성된 파지 칵테일을 동일 비율로 구축하였고, 이는 다제내성 대장균 균주들에 대하여 넓은 숙주 범위를 갖는다. 해당 파지 칵테일은 다제내성 대장균 균주의 85.7%(18/21)를 제어하였다. 투과전자현미경 분석을 통해 세 개 파지 모두 Myoviridae family에 속함을 확인하였다. 파지들의 활성은 4-55°C와 pH 3-11 범위에서 각각 안정성을 보였다. 파지의 성장 곡선 분석 실험에서, 파지 ELSA1, ELSA2, 그리고 ELT4는 각각 세포 당 33, 160, 45 플라크 형성 단위만큼의 증폭량을 가짐을 확인하였다. 파지의 전유전체 서열 분석 결과 ELSA1, ELSA2, 그리고 ELT4는 각각 약 170, 110, 그리고 165 kb의 유전체 크기를 가짐을 확인하였다. 파지의 수용체 분석 결과 ELSA1은 지질다당류와 외막단백질 A를, ELT4는 Tsx 단백질을 숙주 감염시에 수용체로 이용하는 것을 확인하였다. 3주의 다제내성 대장균 균주 각각과 혼합 균주에 대한 단일 파지 및 파지 칵테일의 균 성장 억제 실험 수행 결과, 세 가지 다른 MOI 조건에서 단일 균주에 대한 파지 칵테일의 항균 능력은 단일 파지의 능력과 유사하였으며, 파지 칵테일은 단일 파지에 비해 다제내성 대장균 혼합 균주의 증식을 더 효과적으로 제어하였다. 식품 적용 실험에서 파지 칵테일은 104의 MOI 조건에서 로메인 양상추 표면의 다제내성 대장균을 4°C 와 25°C에서 효과적으로 감소하였다. 파지 칵테일과 8 개 항생제 (시프로플록사신, 레보플록사신, 메로페넴, 이미페넴, 세프타지딤, 세프트리악손, 암피실린, 타조신)를 이용한 checkerboard 적정 실험에서, 파지 칵테일은 메로페넴 혹은 이미페넴과 함께 투여되었을 때 세 다제내성 대장균 혼합 균주의 증식을 억제함에 있어 synergy effect를 보였다. 종합하면, 본 연구에서 구축된 파지 칵테일은 다양한 다제내성 대장균에 대하여 단일 파지에 비해 개선된 항균 효과를 보였다. 더 나아가, 식품 및 checkerboard 실험 결과를 바탕으로 본 연구에서 이용된 파지 칵테일은 생물학적 방제제로서 활용도가 높은 것으로 사료된다.

Multidrug-resistant (MDR) bacteria are increasing globally and necessitate the development of new treatment agents. Escherichia coli is a gram-negative bacterium responsible for various diseases, and the emergence of MDR E. coli has been reported in various countries. Bacteriophages (phages) are considered a promising alternative to antibiotics, and phage cocktails are generally used to broaden host ranges in phage treatment. In this study, phages infecting multiple MDR E. coli clinical isolates were isolated. The biochemical and genomic characterizations of phages were conducted, and the efficiency of infection of the phage cocktail with a broad host range was evaluated in diverse conditions. A total of twenty-one E. coli clinical isolates resistant to various groups of antibiotics were used in the study. Six E. coli phages were isolated, and based on the host range determination, the phage cocktail composed of phages ELSA1, ELSA2, and ELT4 with the broad host range against MDR E. coli strains were constructed in equal ratio. The phage cocktail controlled 85.7% (18/21) of MDR E. coli strains. Three phages were classified as the Myoviridae family based on transmission electron microscopy (TEM) analysis. Phage viabilities were stable between 4-55°C and pH 3-11, respectively. In the one-step growth curve analysis, phages ELSA1, ELSA2 and ELT4 showed burst sizes of 33, 160, and 45 plaque-forming units per cell, respectively. Whole-genome sequencing of phages revealed that genome sizes of ELSA1, ELSA2 and ELT4 were 169,532, 110,683, and 165,114 bp, respectively. Results of phage receptor analysis indicate that ELSA1 uses LPS and OmpA, but ELT4 uses Tsx as receptors to infect the hosts. Phage inhibition assays using single phages and the phage cocktail against three MDR E. coli strains or mixed culture of them revealed that the antibacterial activities of the phage cocktail were comparable to that of single phage against MDR E. coli strains at three different MOIs. Also, the phage cocktail controlled mixed culture of MDR E. coli more effectively compared to single phage treatments. In food application, the phage cocktail treatment at a MOI of 104 effectively reduced MDR E. coli on surface of romaine lettuce at 4℃ and 25℃. In the checkerboard titration assays using the phage cocktail with 8 antibiotics (ciprofloxacin, levofloxacin, meropenem, imipenem, ceftazidime, ceftriaxone, ampicillin and piperacillin-tazobactam), phage cocktail showed synergy effects in controlling the mixed culture of three MDR E. coli strains when inoculated with meropenem or imipenem from carbapenems class. In conclusion, the results indicate that the phage cocktail designed in this study showed improved antibacterial activity against various MDR E. coli compared to single phage. Furthermore, results of food application and the checkerboard assays show that the phage cocktail used in the study is highly utilized as a biocontrol agent.