Alteration of Thyroid Hormone Regulation by Acetyl Tributyl Citrate (ATBC) in Embryo-Larval and Adult Zebrafish (Danio rerio)

Abstract

Acetyl tributyl citrate (ATBC) is a citrate used as a plasticizer to replace di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP). ATBC has been increasingly used for various purposes, including food additives, product coatings, and pharmaceutical excipients, and hence has been detected in indoor environments and products including processed foods, packaging, and medical tubing. Because of a lack of information on the major metabolites of ATBC, biomonitoring studies on ATBC have seldom been performed. In the present study, we evaluated the thyroid hormone-disrupting potential of ATBC, using both embryo-larval and adult male zebrafish. Changes in major gene transcription related to thyroid hormone homeostasis and thyroid hormones were analyzed. Zebrafish embryos were treated with a series of sublethal concentrations of 0, 0.003, 0.03, and 0.3 mg/L. DMSO 0.01% (v/v) was used as a solvent. For embryo-larval fish, four replicates of 300 embryos and 30 embryos were employed for each concentration for five hormones (TSH, TT3, FT3, TT4, and FT4) and gene analysis, respectively. In the adult fish experiment, exposure was carried out for 14 days in 4 repeated groups of 10 organisms each in a 5L beaker containing 4L of ATBC exposure media: 0, 0.1, 0.3, 1 mg/L with DMSO 0.01% (v/v). On the last day of exposure, plasma collected from the caudal vein of the fish was diluted and TSH, TT3, and TT4 were measured. Following the exposure, larval zebrafish (5 dpf) showed a dose-dependent increase in T3 and T4 levels. Several key genes of the HPT axis showed alterations in transcription. 𝘤𝘳𝘩β and 𝘵𝘳𝘩 genes associated with the central regulations were upregulated. In addition, 𝘵𝘨 and 𝘯𝘪𝘴 genes showed upregulation, although statistical significance was not reached. Genes such as 𝘶𝘨𝘵1𝘢𝘣 and 𝘴𝘶𝘭𝘵1𝘴𝘵5 which are related to thyroid hormone elimination were downregulated, supporting increased TH levels in whole-body larvae. In adult zebrafish after exposure to 14 days, TSH was significantly decreased, but TT4 level was increased except for the highest exposure group. These observations suggest that ATBC has the potential to disrupt thyroid hormone balance in both life stages in zebrafish but showed different patterns of alteration. This is the first observation to show the potential thyroid-disrupting effects of ATBC in zebrafish which is comparable to reported observations for DEHP. Further studies on its consequences are warranted.

Acetyl tributyl citrate(ATBC)는 DEHP를 대체하여 사용되는 citrate계열의 비프탈레이트계 대체가소제이다. ATBC는 식품 첨가제부터 제품 코팅제, 그리고 의약품 코팅제 등에 이르기까지 매우 다양한 용도로 사용되고 있어 실내 환경이나 가공식품, 포장재, 의료용 튜빙 등의 제품에서 검출되고 있다. ATBC의 주요 대사체에 대한 정보가 부족하여 바이오모니터링 및 관련 건강영향에 대한 역학 연구는 거의 수행되지 않았다. 본 연구에서는 프탈레이트계 가소제의 주요한 대체물질인 ATBC의 갑상선 호르몬 및 관련 유전자 교란 영향을 제브라피쉬의 두 가지 발달단계인 배아-치아 및 수컷 성어에서 평가하였다. 갑상선 호르몬 항상성 조절과 관련된 주요 유전자의 전사 수준 변화와 갑상선 호르몬을 분석하였다. 제브라피쉬의 배아는 DMSO 0.01% (v/v)를 용매로 사용한 0, 0.003, 0.03, 0.3 mg/L의 sublethal한 농도의 ATBC 노출수에 5일간 노출하였다. 각 반복군 당 각각 배아 300개와 30개씩 4반복군으로 노출시킨 후, 다섯개의 호르몬(TSH, TT3, FT3, TT4, FT4)과 호르몬 조절과 관련된 유전자 분석을 진행하였다. 성어단계에서는 DMSO 0.01% (v/v)를 용매로 사용한 0, 0.1, 0.3, 1 mg/L 농도의 4L 노출수가 담긴 5L 비커에 각 반복군 당 10마리씩 4반복군으로 14일간 노출하였다. 노출 마지막 날, 성어에서 채취한 혈장을 희석하여 3개의 갑상선 호르몬 (TSH, TT3, TT4)와 뇌, 간, 갑상선에서 호르몬 조절과 관련된 유전자를 분석하였다. ATBC에 5일 간 노출된 배아-치어 단계의 제브라피쉬에서는 T3와 T4 모두 Total form과 Free form에서 농도 의존적으로 증가하는 결과를 보였다. 𝘊𝘳𝘩β 와 𝘵𝘳𝘩와 같은 갑상선 호르몬 조절을 담당하는 유전자 발현의 유의한 증가가 나타났고 갑상선 호르몬 합성과 관련된 𝘵𝘨와 𝘯𝘪𝘴가 증가하는 경향이 관찰되었다. 또한, 갑상선 호르몬 제거를 담당하는 𝘶𝘨𝘵1𝘢𝘣와 𝘴𝘶𝘭𝘵1𝘴𝘵5와 같은 유전자의 발현 감소 결과가 나타났다. ATBC에 14일 노출된 성어 제브라피쉬에서는 TSH가 뚜렷하게 감소하는 경향을 보였다. 이러한 결과는 ATBC에 노출되었을 때, 제브라피쉬의 두 가지 발달단계에서 갑상선 호르몬 조절을 교란할 가능성이 있다는 것을 시사하였다. 이 연구는 DEHP의 대체물질인 대체가소제 ATBC의 갑상선 교란 독성에 대한 첫 번째 in vivo 연구이며 해당 결과에 대해 추가적인 연구가 필요할 것이다.