Proteomic profiling of cuprizone-induced demyelination in the mouse hippocampus

Abstract

다발성경화증(multiple sclerosis)은 수초의 손상을 특징으로 하는 자가면역성 질환이다. 이러한 특징 때문에, 탈수초 현상을 일으키는 큐프리존(cuprizone) 모델은 다발성경화증 연구에 널리 사용되고 있다. 이번 실험의 목적은 큐프리존을 통한 탈수초화 및 재수초화 과정에서 해마에서 유의적으로 변화하는 단백질을 확인하고, 몇 가지의 단백질을 통해 탈수초화 억제를 유도할 수 있는 단백질을 도출하고자 하였다. 5주령 마우스에 8주간 큐프리존이 첨가된 사료 섭취 또는 5주간 큐프리존 사료 섭취 및 3주 정상 사료 섭취를 통해 수초화 및 탈수초화 모델을 유도하였다. 큐프리존 섭취로 인해 해마에서 수초의 손상이 유도되었으며, 해마의 과립 밑 구역에서 세포증식, 신경모세포 분화 및 CREB 신호를 유의적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 반면에, 큐프리존 섭취를 중단하고 일반사료로 전환한 결과로 수초, 세포증식, 신경모세포 및 CREB 신호전달이 해마에서 유의적으로 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 이후에, 단백질 발현을 조사하기 위해 2차원 겔 전기영동(2DE) 및 액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS) 기반 정량화 방법을 사용하였다. 큐프리존 식이 중 발현된 단백질과 큐프리존 섭취를 중단 후 발현된 단백질 중에서 유의적으로 변화하는(2배 이상 증가 또는 감소) 리스트를 확인하였으며, 그중에서 큐프리존 식이를 할 때는 발현이 감소하고 큐프리존 식이를 중단했을 때 발현이 증가하는 단백질들을 확인하였다. 그 이유는, 이러한 변화 경향을 보이는 단백질이 탈수초화 및 수초화에 직접 관여할 것으로 생각했기 때문이다. 케티민환원효소 뮤-크리스탈린(CRYM)과 단백질 이황화이소머라제 A3 전구체(PDIA3)를 확인할 수 있었으며, 정확한 조직 내에서 변화를 확인하기 위하여, CRYM와 PDIA3에 대한 면역조직화학염색을 수행하였다. 그 결과 탈수초화 시 해마의 CA1에서 유의하게 감소하고 재수초화 시 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 단백질 분석 및 면역염색의 결과는 같았다. 이 두 단백질을 큐프리존 식이 중에 실험 동물에게 직접 투여하여 해마에서 수초화, 신경세포재생 등의 변화를 확인하였다. 단백질의 혈관 뇌 투과성 및 세포 내 투과성을 높이기 위하여, Tat-융합단백질인 Tat-CRYM 및 Tat-PDIA3를 제조하였다. 실험동물군은 대조군, 큐프리존 식이군, 큐프리존 식이와 Tat-CRYM을 투여한 군, 그리고 큐프리존 식이와 Tat-PDIA3를 투여한 군으로 나누었으며, 큐프리존을 함유한 식이는 8주간, Tat-CRYM 및 Tat-PDIA3 단백질은 마지막 4주간 복강 내로 하루에 1회 투여를 하였다. 면역염색 결과, Tat-CRYM과 Tat-PDIA3를 각각 투여한 그룹에서 큐프리존 식이군 대비 해마의 세포증식과 신경모세포 분화가 유의적으로 증가하였다. 반면, Tat-PDIA3 투여군에서만 수초와 CREB 신호가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 Tat-PDIA3가 CREB 신호의 인산화를 증가시킴으로써 해마에서 큐프리존 유도 탈수초화 및 해마 신경 생성의 감소를 개선한다는 것을 시사한다. 결론적으로, 큐프리존 급여는 탈수초화를 유도하며, 이와 함께 해마에서 세포증식, 신경모세포분화를 억제하며, 이는 CREB 신호를 억제하는 것과 연관이 있었다. 반면, 큐프리존 식이를 중단함으로써 재수초화 과정에서 해마에서는 수초화, 세포증식, 신경모세포분화, CREB 신호가 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 탈수초화와 재수초화 과정을 단백질 분석을 통해 탈수초화시에는 발현이 감소가 되고 재수초화시에 발현이 증가하는 단백질로 CRYM과 PDIA3의 존재를 확인하였다. 탈수초화 상태에서 CRYM과 PDIA3를 투여한 결과, 두 투여군 모두 해마의 세포증식과 신경모세포 분화가 개선되었으며 PDIA3에서만 말이집과 CREB 신호가 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, PDIA3는 탈수초화 및 재수초화에서 매우 중요한 역할을 하며, 이러한 단백질은 탈수초화의 예방 또는 치료를 위한 접근 방식이 될 수 있다. 이러한 결과로 PDIA3의 다발성경화증 치료제의 가능성을 제시할 수 있다.

Multiple sclerosis is characterized by the autoimmune attack on myelin sheath in the central nervous system. The cuprizone model, which induces demyelination, has been widely used in multiple sclerosis research. In the present experiment, I sought to examine the changes in hippocampal proteomic profiles during demyelination and remyelination using the cuprizone model. First, the experimental animals were divided into three groups: a group receiving normal chow diet for 8 weeks (control), a group receiving cuprizone-supplemented diet for 8 weeks, and a group receiving normal chow diet for 3 weeks following cuprizone-supplemented diet for 5 weeks. The cuprizone-supplemented diet significantly reduced myelin sheath, cell proliferation, neuroblast differentiation, and cAMP response element-binding protein (CREB) signaling in the hippocampus. Meanwhile, cessation of cuprizone intake significantly ameliorated the reduction in myelin sheath, cell proliferation, neuroblast differentiation, and CREB signaling in the hippocampus. Next, two-dimensional gel electrophoresis (2DE) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based quantification methods were applied for hippocampal protein profiling following demyelination and remyelination. Expression of various proteins in the hippocampus was altered by over two-folds following cuprizone intake or termination. Among the identified proteins, the expression of only ketimine reductase mu-crystallin (CRYM) and protein disulfide isomerase A3 precursor (PDIA3) was decreased after cuprizone intake and increased after cuprizone termination. To validate the protein expression patterns in the hippocampus, immunohistochemical staining was performed. Both PDIA3 and CRYM were significantly downregulated in hippocampal CA1 region upon demyelination and upregulated upon remyelination. Immunostaining of PDIA3 and CRYM in the hippocampus was weakened during demyelination and intensified during remyelination. Overall, the results of protein analysis and immunostaining were consistent. Furthermore, I investigated the protective effects of CRYM and PDIA3 against cuprizone-induced demyelination in the hippocampus. To ease the crossing of proteins through the blood–brain barrier, I synthesized Tat peptide-fusion proteins, including Tat-CRYM and Tat-PDIA3. The experimental animals were divided into four groups: a control group, a group receiving cuprizone diet, a group receiving Tat-CRYM plus cuprizone diet, and a group receiving Tat-PDIA3 plus cuprizone diet. Immunofluorescence staining revealed that the reduction in proliferating cell count and neuroblast differentiation was alleviated in groups receiving Tat-CRYM and Tat-PDIA3, respectively, compared with those in the group receiving cuprizone alone. Meanwhile, significant ameliorative effects on myelin basic protein expression and CREB signaling in the hippocampus were noted only in the group receiving Tat-PDIA3 plus cuprizone. These results suggest that Tat-PDIA3 ameliorates cuprizone-induced demyelination and reduction in hippocampal neurogenesis by promoting phosphorylation in CREB signaling. In conclusion, cuprizone intake reduces myelin sheath, cell proliferation, neuroblast differentiation, and CREB signaling in the hippocampus, while cuprizone termination ameliorates these effects during remyelination. Through hippocampal proteomic analysis during demyelination and remyelination, the existence of CRYM and PDIA3, the only proteins whose expression was suppressed during demyelination and promoted during remyelination, was confirmed, and immunostaining corroborated these findings. Administration of both CRYM and PDIA3 in the demyelinated state improved cell proliferation and neuroblast differentiation in the hippocampus, while PDIA3 administration alone improved myelin and CREB signaling. In addition, hippocampal neurogenesis is closely related to the growth of neurons and phosphorylation in CREB signaling. Therefore, PDIA3 may be useful for the prevention or treatment of demyelination, suggesting its therapeutic potential in multiple sclerosis.