Optimization and application of CRISPR technologies in human pluripotent stem cells

Abstract

인간만능줄기세포는 최근 급격히 진보한 유전자 편집 기술의 적용으로 동질 유전자 쌍 질환 모델을 통한 약물 스크리닝과 질환 기작 연구 및 세포치료제로서의 가능성을 드러내고 있다. 하지만, 인간에서 발견되는 질병 관련 돌연변이들은 대부분 (~48%) 점 돌연변이로, 이를 인간만능줄기세포 모사 또는 교정하기 위해선 유전자 편집은 정밀한 방식으로 이뤄져야한다. 정밀 유전자 편집 기술은 대표적으로 Cas9과 공여 DNA를 통해 이뤄지는 knock-in (KI)과 비교적 최근 개발된 유전체 편집 기술인 base editors (BEs) 그리고 prime editor (PE)가 있다. 하지만, Cas9에 의한 KI는 DNA 이중 가닥 절단 (double strand break; DSB)을 일으키며 이는 중대한 돌연변이인 거대 유전정보 손실을 초래한다. 반면, BEs와 PE는 nickase Cas9 (nCas9)을 기반으로 하며, nCas9은 거대 유전정보 손실을 일으키지 않는 DNA 단일 가닥 절단 (single strand break; SSB)을 유도하기 때문에 Cas9에 의한 KI보다 월등한 안정성을 보인다. 따라서, 인간만능줄기세포의 유전정보 편집은 Cas9에 의한 KI보다 BEs와 PE를 활용하는 것이 더욱 안전한 접근이라 생각된다. 하지만, 인체의 모든 세포가 유래될 수 있는 인간만능줄기세포는 유전정보의 보존을 위해 DNA 손상 반응 및 DNA 수리 기작이 활성화된 특징을 갖는다. 이러한 인간만능줄기세포의 특징이 Cas9을 통한 인간만능줄기세포에서의 유전자 편집을 저해하는 것으로 알려져 있지만 BEs나 PE와 같은 유전자 편집기술과 인간만능줄기세포의 특징과의 연관관계는 많은 부분이 밝혀져 있지 않다. 본 논문을 통해 인간만능줄기세포의 특징과 염기편집기술의 상관관계를 이해하고 최적화하며, 적용한 사례를 다음과 같은 연구를 통해 정리한다. (i) 인간만능줄기세포에서의 일시적 약물 저항성유도를 통한 CRISPR/Cas9 최적화 (ii) 인간만능줄기세포의 특징이 BEs 효율에 미치는 영향 (iii) 인간만능줄기세포의 특징이 PE 효율에 미치는 영향 (iv) 인간만능줄기세포에 최적화된 BEs와 PE 개발 (v) BEs를 통한 GNE근질환 모델 확립 및 돌연변이특이적 표현형 발굴.

Owing to the advance in genome editing technology, human pluripotent stem cells (hPSCs) have recently undergone breakthroughs that make it possible to precisely alter the necessary bases in hPSCs for the creation of isogenic disease models and ex vivo cell therapy. As the majority of pathogenic variants belongs to point mutations, precise substitution of pathogenic base in hPSCs, enables researchers to study the disease mechanism with disease-in-a-dish, and to provide the functionally corrected cells to the patients for cell therapy. To this aim, other than conventional homologous directed repair for the knock-in strategy based on endonuclease activity of Cas9 (i.e., gene editing scissors), diverse toolkits for desired base substitution (i.e., gene editing pencils) to avoid unnecessary insertion and deletion (indel) mutations as well as harmful large deletions, have been developed and applied to hPSCs. However, unlike differentiated somatic cells, the unique cellular properties of hPSCs to maintain the genome integrity, largely determine the overall efficiency of editing tools. Throughout several researches, I have revealed that not only DNA damage response but also DNA repair pathway largely determines the outcome of cytosine base editor (CBE) and prime editor (PE) in hPSCs. On top of these researches, I have developed optimized CBE and PE for hPSCs (i.e., BE4stem and PE4stem) via inhibiting both DNA damage response and DNA repair pathway. Also, by applying precise genome editing technologies, I have established multiple isogenic disease models for GNE myopathy which showed mutation specific phenotype. In addition, establishment of hypo-immune hPSCs without DNA double strand break (DSB) was enabled by recently developed precise genome editing technologies.