A Feasibility Study of Cell Membrane Engineering for PSMA-Targeted Cell Therapy and Trafficking

Abstract

세포치료제는 줄기세포 또는 면역세포 등 세포를 기반으로 하는 치료법이다. 특히, 면역조절세포치료제는 수지상세포(dendritic cell), 자연 살해 세포(natural killer cell), T 세포 등의 면역세포를 이용하여 면역반응을 활성화시켜 질병 치료에 사용되는 의약품이다. 면역조절세포치료제 중 최근 임상적으로 활발히 연구가 진행되고 있는 CAR-T는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptors, CARs)를 발현하는 유전자를 T 세포에 도입하여 발현하는 개념으로, 현재 국외에서도 승인이 기대되는 신기술 분야이다. 그러나 이러한 CAR-T 치료법 역시 충분한 표적화가 이루어지지 않을 경우 on-target/off-tumor effect의 부작용으로 인한 한계점도 가지고 있다. 이러한 표적능의 한계와 부작용을 극복하기 위해 이중특이성(bispecific) CAR-T를 개발하거나 CAR의 성능과 효능을 향상시키기 위한 노력이 이루어지고 있다. 이러한 CAR-T 세포와 같은 면역세포치료의 문제점을 극복하기 위해서는 면역세포와 종양세포 간의 상호작용(cell-cell interaction)이 중요하며, 특히 이는 세포 표면의 리간드와 수용체 간의 결합이 중요하게 작용한다. 예로, CAR-T에 이용되고 있는 CD20, CD22, HER2 등이 종양세포의 표적화에 이용되고 있다. 이러한 두 세포들 간의 결합이 강화되면 보다 효과적인 항암치료를 기대할 수 있다. 최근 당대사공학(metabolic glycoengineering)을 사용하여 세포 표면에서 당구조물의 발현을 조절한 다음, 생물직교 화학(bioorthogonal click chemistry)를 사용하여 인공적인 표적 리간드와 같은 구조를 결합하는 방법이 제시되고 있다. 당대사공학은 인공 당과 당단백질 합성과정을 이용하여 세포 표면에 화학적 표지가 가능한 수용체를 도입할 수 있는 기술이다. Azide 반응기는 N-azifoacetyl-mannosamine(Ac4ManNAz) 등의 기질을 이용하여 화학적 표지를 위해 세포 표면에 형성될 수 있다. 이후 생물직교 화학반응으로 결합이 가능한 다양한 구조물을 쉽고 빠르게 시험관 내 또는 생체내에서 결합할 수 있는 장점이 있다. 본 학위 논문의 목표는 당대사공학 및 클릭 반응을 이용하여 면역세포치료제에서 전립선특이막항원(prostate specific membrane antigen, PSMA)에 대한 표적화 능력을 높이고 PET 영상을 이용하여 세포추적을 시각화하는 것이다. THP-1 세포를 다양한 농도(0, 5, 10, 20, 50, 100 μM)의 Ac4ManNAz와 함께 24 시간 동안 처리하여 세포 표면에 반응성 작용기를 발현시켰다. 당대사조작된 세포를 DBCO-bearing fluorophore (ADIBO-Cy5.5)를 이용하여 1 시간 동안 다양한 농도조건(0, 5, 10, 20, 50, 100 μM)에서 처리하여 염색하였다. 이를 공초점 형광 현미경 및 유세포 분석법을 이용하여 분석을 진행함으로써 당대사공학 및 클릭 반응을 이용하여 THP-1 세포의 표면에서 생체직교 결합이 일어남을 확인하였다. THP-1 세포의 표면에 PSMA 표적화 리간드를 무장시키기 위해 Ac4ManNAz가 처리된 THP-1 세포에 최종농도 100 μM의 DBCO-PSMA ligand (ADIBO-GUL)를 처리하고 1 시간 배양하였다. 세포 인식에 대한 효과를 평가하기 위해, PSMA 리간드가 무장된 THP-1 세포(작용 세포)와 PSMA 양성 종양세포인 22RV1 세포 또는 PSMA 음성 종양세포인 PC3 세포(표적 세포)를 Effector-to-target 비율 3:1로 공동배양 하였다. 이때 THP-1 세포(작용 세포)와 표적 세포 사이의 상호작용을 공초점 형광 현미경을 이용하여 확인하였고, PSMA 표적구조를 포함하지 않은 THP-1 세포를 음성 대조군으로 이용하였다. [89Zr]Zr(oxinate)4는 음이온 교환 카트리지르 이용하여 oxalate 구조로부터 합성되었다. 합성된 [89Zr]Zr(oxinate)4의 친유성을 확인하기 위해 LogD7.4가 측정되었다. 이후 방사성 표지된 THP-1 세포를 준비하기 위해, ~740 kBq 수준의 [89Zr]Zr(oxinate)4를 이용하여 5×106 개의 세포를 표지하였다. 방사성 표지된 세포는 감마 카운터를 이용하여 세포에 표지된 방사능을 측정하였고, MTS 방법을 이용하여 최대 7일까지의 세포 생존능을 확인하였다. [89Zr]Zr(oxinate)4로 방사성 표지된 PSMA 표적 리간드 무장 THP-1 세포를 정상 마우스의 꼬리 정맥을 통하여 투여한 뒤 2 시간, 1, 4, 6일에 각각 PET 영상이 획득되었다. 세포독성시험에서, THP-1 세포는 Ac4ManNAz 또는 ADIBO-Cy5.5의 최대 처리 농도인 100 μM까지 어떠한 독성도 확인되지 않았다. 공초점 형광 현미경 영상과 유세포 분석법에서, THP-1 세포는 ADIBO-Cy5.5의 처리용량에 비례한 효율적 표지를 확인하였다. 효율적 세포 표면 표지에 대한 최적농도로써 100 μM이 이후 실험에서 사용되었다. 작용 세포와 표적 세포 사이의 결합은 PSMA 음성인 PC3 세포에서 관찰되지 않았다. 22RV1 세포에서도 음성 대조군으로 사용된 THP-1 세포와의 세포 간 결합이 나타나지 않았다. 하지만 PSMA 리간드 무장 THP-1 세포와 22RV1 세포 사이의 세포 간 결합이 확인되었으며, 이는 두 가지 유형의 세포 사이에서 세포 표면의 표적화 리간드에 의한 세포 간 인식이 일어남을 보여준다. [89Zr]Zr(oxinate)4의 LogD7.4 측정값은 1.47 ± 0.02로, 친유성을 확인하였고, 세포 방사성 표지 효율은 54.4 ± 17.8%였다. 단일 세포 당 0.09 ± 0.03 Bq로 표지된 THP-1 세포는 방사성 표지 후 7일까지 방사성 표지가 되지 않은 대조군 THP-1 세포와 비교하여 유의한 세포독성을 나타내지 않아 방사성 표지에 의한 세포 독성은 확인되지 않았다. 마우스에 투여된 THP-1 세포는 가장 먼저 폐에 높은 비율로 축적되었다가, 이후 시간이 지남에 따라 점차 간, 비장 등의 다른 장기로 이동함을 확인하였다. 위 방법을 통하여 PSMA 표적 세포를 준비하기 위해 100 μM의 Ac4ManNAz를 처리하고, PSMA 표적 리간드(ADIBO-GUL)를 이용하여 효율적으로 세포를 무장할 수 있음을 성공적으로 입증하였다. 또한 [89Zr]Zr(oxinate)4를 이용하여 세포에 대한 독성 없이 세포를 방사성 표지 할 수 있음을 확인하였다. 이는 PSMA 리간드 무장 세포 요법이 세포 표적화 능력을 개선하고 PET 영상을 이용하여 세포의 체내 이동을 추적할 수 있음을 제안하였다.

Cell therapy is based on cells such as stem cells and immune cells. In particular, immunomodulatory cell therapy treats diseases by activating the immune response using immune cells such as dendritic cells, natural killer cells, and T-cells. Among them, a concept of introducing a gene expressing a chimeric antigen receptor into T cells (CAR-T) has been developed recently for cancer treatment and is expected to be approved internationally. However, these CAR-T-based therapies have some limitations due to side effects of on-target/off-tumor effects when adequate targeting is not achieved. To overcome the limitations and side effects of these targeting capabilities, efforts are being made to develop bispecific CAR-T cells or to improve the performance and efficacy of CARs. Metabolic glycoengineering is a technology that can introduce receptors that can be chemically labeled on the cell surface using artificial sugar and glycoprotein synthesis. Reactive azide groups can be formed on the cell surface for chemical labeling using a substrate such as N-azidoacetyl-mannosamine (Ac4ManNAz). After that, it can easily and quickly combine various structures that be conjugated by bioorthogonal chemical reactions in vitro or in vivo. This study aimed to increase the targeting ability against PSMA in cell therapy using metabolic glycoengineering and click reaction and visualize cell trafficking using PET imaging. THP-1 cells were incubated with Ac4ManNAz at various concentrations (0, 5, 10, 20, 50, and 100 µM) for 24 h to incorporate reactive functional groups on the cell surface. Metabolically glycoengineered cells were stained by DBCO-bearing fluorophore (ADIBO-Cy5.5) for 1 h at different concentrations (0, 5, 10, 20, 50, and 100 µM) and analyzed by confocal fluorescence microscopy and flow cytometric assay. For PSMA ligand attachment to THP-1 cells, Ac4ManNAz treated THP-1 cells were incubated with DBCO-PSMA ligand (ADIBO-GUL) at a final concentration of 100 µM for 1 h. To evaluate the effect on cell recognition, PSMA ligand-armed THP-1 cells (as effectors) were co-cultured with PSMA-positive, 22RV1 cells or PSMA-negative, PC3 cells (as target cells) at a 3:1 effector-to-target cell (E/T) ratio. The interaction between THP-1 and target cells was monitored by confocal fluorescence microscopy. THP-1 cells were used without a PSMA targeting motif as a negative control. [89Zr]Zr(oxinate)4 was prepared from its oxalate form by using an anion exchange sep-pak cartridge. LogD7.4 assay was performed to confirm the lipophilicity of the synthesized [89Zr]Zr(oxinate)4. For preparing the radiolabeled THP-1, the cells were treated at the activity level of ~740 kBq of [89Zr]Zr(oxinate)4/5×106 cells. Radiolabeled cells were analyzed for determination of cell-associated radioactivity by gamma counting and cell viability was measured up to 7 day by MTS assay. PSMA targeting ligand armed THP-1 cells radiolabeled with [89Zr]Zr(oxinate)4 was injected into normal mice through the tail vein. PET images were obtained at 2 hours, 1, 4, and 6 days after injection. In the cytotoxicity assay, THP-1 cells did not present cytotoxicity even when the Ac4ManNAz or ADIBO-Cy5.5 treated concentration was 100 µM. In confocal imaging and flow cytometric assay, ADIBO-Cy5.5 efficiently labeled THP-1 cells in a dose-dependent manner, and the dose of 100 µM was the optimum concentration for the following experiments. Intercellular gluing was not observed in PSMA negative PC3 cells. 22RV1 cells did not show cell-to-cell gluing with non-armed THP-1 cells. However, the clusters of PSMA ligand-armed THP-1 cells and 22RV1 were identified, indicating cell-cell recognition over the cell surface between two types of cells. LogD7.4 of [89Zr]Zr(oxinate)4 was determined as 1.47 ± 0.02. Cell radiolabeling efficiency was 54.5 ± 17.8%. THP-1 labeled with 0.09 ± 0.03 Bq/cell showed no significant cytotoxicity compared to unlabeled THP-1 up to 7 days. Injected THP-1 cells accumulated in the lung and gradually moved to other organs, such as the liver and spleen, over time. Ac4ManNAz treated cells were prepared efficiently and labeled with ADIBO-GUL for preparing the PSMA-targeted cells. [89Zr]Zr(oxinate)4 can be used to label cells without toxicity. The study results suggest that PSMA-ligand armed cell therapy could improve cell targeting efficacy and be monitored by PET imaging.