Targeted massive parallel sequencing and comprehensive phenome-genome assessment in neuromuscular patients without genetic etiology by conventional diagnostic methods

Abstract

Neuromuscular disorders are clinically, pathologically, and genetically heterogeneous groups of disorders. An accurate genetic diagnosis has often been challenging due to the heterogeneity and complexity of these groups of disorders. The advent of next generation sequencing (NGS) technologies have started a new era of molecular genetic diagnosis in neuromuscular disorders. It is an effective diagnostic tool for the parallel investigation of a large number of genes and has been increasingly used in the recent clinical and research fields. In this study, NGS-based targeted sequencing panels were applied to the diagnostic workflow in the genetic characterization of 327 patients who were suspected of having a hereditary neuromuscular disorders but without a definite molecular diagnosis using traditional genetic analysis. Four sets of targeted sequencing panels prepared at different times and were sequentially applied. Fifty eight patients were sequenced for 579 genes, 29 patients for 383 genes, and 150 patients for 436 genes. The last 90 patients were analyzed with tests selected among 6 custom panels for congenital myopathies, congenital muscular dystrophies, limb girdle muscular dystrophies, metabolic myopathies, myofibrillar myopathies, and Charcot-Marie-Tooth diseases. Each panel contains 29 to 79 genes according to the clinical subgroups. Pathogenic mutations were confirmed in 161 cases (49.2%) out of 327 patient. The diagnostic yield by phenotype groups were 62.7% in congenital muscular dystrophies (n = 47), 45.3% in limb girdle muscular dystrophies (n = 43), 54.3% in congenital myopathies (n = 50), 80% in congenital myasthenic syndromes (n = 4), 14.3% in metabolic myopathies (n = 3), 35.3% in motor neuron disorders (n = 6), 50% in hereditary motor and sensory neuropathies (n = 3), and 31.3% in other neuromuscular disorders (n = 5) respectively. The causative mutations were found in 50 different genes and the six most frequently found genes were COL6A1 (n = 21), RYR1 (n = 18), DMD (n = 10), COL6A2 (n = 9), ACTA1 (n = 7), and LMNA (n = 7) in order. This study illustrates the clinical utility of targeted NGS as a powerful diagnostic tool in hereditary neuromuscular disorders. Integrated phenome-genome analysis is very important for improving the diagnostic efficiency of this technique. It is necessary to establish a comprehensive diagnostic platform for the molecular diagnosis of neuromuscular disorders that integrates single gene testing and NGS based on the phenotype analysis.

유전성 신경근육질환은 골격근 또는 말초 운동신경계의 이상으로 인해 근위축 및 근력저하가 발생하는 다양한 질환을 통칭하는 복합적인 진단명으로 임상적, 병리학적, 분자유전학적 복합성으로 인해 정확한 유전 진단이 어려운 경우가 흔하다. 차세대 염기서열분석은 대량의 유전자에 대한 병렬 분석이 가능하다는 기술의 효율성으로 인해 임상 및 연구 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있다. 본 연구에서는 기존의 표준 진단 방법으로 유전적 병인을 발견하지 못한 327명의 신경근육질환 환자에 대해 차세대 염기서열분석 기반 대규모 표적 병렬 시퀀싱 분석을 적용하였다. 순차적으로 대상 표적유전자를 업데이트한 패널이 분석에 이용되었고 58명의 환자는 579개의 유전자에 대해 29명의 환자는 383개의 유전자에 대해 150명의 환자는 436개의 유전자에 대해 시퀀싱을 진행하였다. 마지막 90명의 환자는 임상진단에 따라 선천성 근병증, 선천성 근디스트로피, 지대형 근디스트로피, 대사성 근병증, 근원섬유 근병증, 유전성 운동 및 감각 신경병증 진단을 위해 개발한 6개의 패널 중에서 선택하여 각각 29~79개의 표적유전자에 대해 분석하였다. 327명의 환자 중 161명 (49.2%)에서 유전적 원인을 확인하였다. 임상표현형에 따른 진단율은 각각 선천성 근디스트로피 62.7% (47명), 지대형 근디스트로피 45.3% (43명), 선천성 근병증 54.3% (50명), 선천 근무력증후군 80% (4명), 대사성 근병증 14.3% (3명), 운동신경 질환 35.3% (6명), 유전성 운동 및 감각 신경병증 50% (3명), 기타 신경근육질환에서 31.3% (5명)이였다. 50개의 서로 다른 유전자에서 원인 돌연변이가 발견되었으며 가장 높은 빈도로 발견된 6개의 유전자는 순서대로 COL6A1 (21명), RYR1 (18명), DMD (10명), COL6A2 (9명), ACTA1 (7명), LMNA (7명)이었다. 본 연구는 유전성 신경근육질환의 진단에서 표적 병렬 시퀀싱의 임상적 유용성 제시하였다. 진단 효율성 향상을 위해서 적절한 표적유전자 선택과 통합적 임상 표현형 및 유전형 분석이 매우 중요하다.