Indel-free prime editing with bona fide Cas9 nickases

Abstract

Unlike CRISPR-Cas9 nucleases, which yield DNA double-strand breaks (DSBs), Cas9 nickases (nCas9s), which are created by replacing key catalytic amino-acid residues in one of the two nuclease domains of S. pyogenesis Cas9 (SpCas9), produce nicks or single-strand breaks. Two SpCas9 variants, namely, nCas9 (D10A) and nCas9 (H840A), which cleave target (guide RNA-pairing) and non-target DNA strands, respectively, are widely used for various purposes, including paired nicking, homology-directed repair, base editing, and prime editing. In an effort to define the off-target nicks caused by these nickases, we performed Digenome-seq, a method based on whole genome sequencing of genomic DNA treated with a nuclease or nickase of interest, and found that nCas9 (H840A) but not nCas9 (D10A) can cleave both strands, producing unwanted DSBs, albeit less efficiently than wild-type Cas9. To inactivate the HNH nuclease domain further, we incorporated additional mutations into nCas9 (H840A). Double-mutant nCas9 (H840A+N863A) did not exhibit the DSB-inducing behavior in vitro and, either alone or in fusion with the M-MLV reverse transcriptase (prime editor), induced a lower frequency of unwanted indels, compared to nCas9 (H840A), caused by error-prone repair of DSBs. When incorporated into prime editor and used with engineered pegRNAs, we found that the nCas9 variant (H840A+N854A) dramatically increased the frequency of correct edits, but not unwanted indels, yielding the highest purity of editing outcomes compared to nCas9 (H840A).

DNA의 이중 가닥 절단을 하는 CRISPR-cas9 뉴클레아제와는 다르게, nickase Cas9 (nCas9)은 spCas9단백질에 존재하는 두 개의 뉴클레아제 도메인의 중요 아미노산을 치환하여 DNA의 단일 가닥만 절단할 수 있게 만들었다. 두 종류의 spCas9의 변이체인 nCas9 (D10A)와 nCas9 (H840A)는 각각 DNA의 표적 가닥과 비표적 가닥을 절단하게 되는데, 이는 paired-nicking, homology-directed repair, base editing 그리고 prime editing에 등에 사용되어 왔다. CRISPR-cas9의 Off-target을 찾는 방법 중 하나인 Digenome-seq은 뉴클리아제 또는 니케이즈를 처리한 genomic DNA를 whole genome sequencing 방법을 기반으로 찾아낼 수 있다. 이 논문에서는 Digenome-seq 방법을 통해서 nCas9 (D10A)와는 다르게 nCas9 (H840A)가 DNA의 비표적 단일 가닥을 자르는 것이 아닌, DNA의 이중 가닥을 모두 절단하는 것을 확인하였다. Cas9의 HNH 도메인의 능력 결실을 위해 다양한 종류의 nCas9 변이체를 생성하였고, DNA 의 이중 가닥이 아닌 비표적 단일 가닥만 절단하는 완전한 니케이즈인 nCas9 (H840A+N863A)를 만들어 낼 수 있었다. 유전자 교정 도구 중 하나인 Prime editor는 프로그램이 가능한 nCas9 (H840A)에 M-MLV reverse transcriptase를 결합시켜 유전자 교정을 일으킨다. 그러나 이 Prime editor의 유전자 교정 결과물에 이중 가닥 절단의 산물인 insertion and deletion (indel)이 nCas9 (D10A)를 사용하는 base editor 보다 높게 나타나는 것을 확인하였고, 완전하게 만든 니케이즈 변이체를 prime editor에 도입하여 원치 않게 발생하는 indel의 비율을 줄일 수 있었다. 더 나아가, 다른 변이체인 nCas9 (H840A+N854A)을 적용시킨 prime editor의 경우 engineered pegRNA (epegRNA)와 함께 사용하였을 때 정확한 유전자 교정 비율을 상승시키는데 효과적이라는 것을 보였다.