Molecular study of Shigella flexneri Bacteriophage-Host Receptor Interaction for Biocontrol

Abstract

시겔라 플렉스네리는 설사를 일으키는 세균성 이질의 중요한 원인균이다. 박테리오파지는 시겔라 제어를 위한 항생제 대안으로 사용될 수 있다. 그러나 박테리아는 자신의 세포 표면의 수용체를 변형하여 파지에 대한 내성을 나타낼 수 있으므로 파지와 숙주 세포의 수용체의 상호작용을 파악하는 것이 중요하다. 본 논문에서는 숙주 수용체와의 상호작용을 기반으로 플렉스네리균의 제어 효율을 증대를 시키고자 시겔라 플렉스네리를 감염시키는 파지들을 분리하였다. 다섯 개 파지의 숙주 수용체를 알아보기 위하여, 시겔라 플렉스네리 2a strain 2457T 야생형 균주에 람다-레드 재조합과 Tn5 트랜스포존을 이용한 다양한 돌연변이 라이브러리를 구축하였다. 그 결과, 세 가지 유형으로 분류할 수 있었다; 지질다당체(LPS)의 outer core, LPS의 O항원, 및 페리크롬-철 수용체인 FhuA. 그 중 파지 SFP21A는 LPS O항원이 수용체로 작용하지만 LPS core의 합성에 직접적으로 영향을 미치는 galU 유전자의 Tn5에 의한 돌연변이 균주를 감염하는 현상을 확인할 수 있었다. 생물정보학적 분석을 통해 SFP21A 파지의 유전정보 안에 감염 특이성을 결정하는 꼬리 섬유 단백질로 추정되는 단백질 Gp09를 찾아냈다. SFP21A의 Gp09는 세 개의 도메인으로 구성된 동종삼량체를 갖으며, 이 중 C-말단 도메인이 수용체 결합에 관여하는 것을 확인하였다. 또한 점 돌연변이 기법을 통한 Gp09의 아미노산 돌연변이는 더 이상 Tn5에 의한 galU 돌연변이 균주에 결합을 하지 못함을 볼 수 있었다. 이는 결합 도메인의 외부 루프에 존재하는 발린이 초기 감염에 중요한 역할을 할 수 있음을 예상할 수 있었다. 결과적으로 이러한 감염 패턴을 통해 LPS outer core가 수용체로 작용하는 SFPB에 대한 저항성 균들을 사용한 닷팅 분석시험에서 SFP21A는 다른 O항원 수용체 유형 파지와 다르게 대부분 감염을 할 수 있는 것을 확인하였다. 따라서 SFP21A, SFPB, 및 FhuA를 수용체로 사용하는 파지 SFP17로 구성된 파지 칵테일은 각각의 파지를 단독으로 처리했을 때에 비해 효과적으로 24시간 동안 박테리아 성장을 저해하였다. 결과적으로 파지와 숙주 수용체와의 상호작용을 알아봄으로써 시겔라 균을 제어할 수 있는 더 효과적인 파지 칵테일을 제조 가능할 것이라고 생각된다.

Shigella is an important causative agent of shigellosis causing diarrhea. Considering the antibiotic resistance, bacteriophage can be used as an antibiotics alternative for controlling Shigella. However, bacterium can become resistant to phage by modifying their cell surface receptor. Therefore, phage treatment that targets various host receptors is more effective than single phage treatment. In this study, new phages targeting Shigella flexneri were isolated and their specific host receptors were identified to understand the phage-host interaction. To identify the host receptors of the five phages (SFPB, SFP17, SFP20, SFP21A, SFP21B), various mutant libraries were constructed using lambda-red recombination and the Tn5 transposon in S. flexneri 2a strain 2457T. The host receptor identification results showed that there were three types of receptors; an outer core of lipopolysaccharide (LPS), an O-antigen of LPS and a FhuA (ferrichrome porin). Phage SFPB uses the outer core as the receptor, while phage SFP20, SFP21A, and SFP21B use the O-antigen of LPS as the receptor. Phage which utilize FhuA for adsorption was SFP17. Interestingly, in the mutation of the galU gene that directly affects the synthesis of the S. flexneri LPS core, SFP21A showed different lytic activity than SFP20 and SFP21B. For further understanding of the host-phage interaction, protein structure prediction was performed and showed that the Gp09 of SFP21A is a receptor binding protein having a homotrimeric structure. The binding activity using EGFP-Gp09 fusion proteins revealed that the C-terminal domain is involved in receptor binding. Furthermore, multiple sequence alignment revealed that one amino acid (V669) at the C-terminus of Gp09 was predicted to be a key residue affecting binding in the galU mutant. Point mutation analysis revealed that the single point mutation in the C-terminal domain (V669A) could no longer bind to the galU mutant, indicating that valine present in the outer loop of the binding domain may play an important role when binding to the host cell surface. Based on these characteristics, a spotting assay was performed to confirm the lytic activity of SFP21A in the phage SFPB-resistant mutant strains. As a result, despite being an O-antigen receptor, SFP21A effectively inhibited the SFPB-resistant bacteria. Therefore, phage cocktail consisting of SFP21A, SFPB, and SFP17 effectively inhibited the bacterial growth and the emergence of resistant strains than the single phages. These results suggest that phage cocktail using phage-host interactions can be applied as alternative biocontrol agents against S. flexneri.