Biochemical analysis of the cystathionine gamma-lyase MccB from Staphylococcus aureus and the inhibition mechanism by natural compound EGCG

Abstract

Staphylococcus aureus is a Gram-positive bacterium known for its multidrug resistance and persistent survival. Hydrogen sulfide (H2S) has been shown to increase drug resistance and persistent survival in S. aureus, which mainly produces H2S through the PLP-dependent enzyme MccB. In this study, molecular reaction mechanisms of S. aureus MccB was first investigated by the structural determination of the wild-type and mutant proteins. The crystal structure of the wild-type MccB protein showed some key residues near the cofactor PLP at the active site of MccB. Mutations of the residues abolished the enzymatic activities of MccB, and the crystal structures of the mutant proteins revealed that both cystathionine γ-lyase and H2S producing activities of MccB share the catalytic residues at the active site of MccB. Also, the enzymatic activity of MccB in H2S production and the inhibitory effects of natural compounds on this enzyme were explored. MccB exhibited a strong cystathionine γ-lyase activity producing cysteine from cystathionine and cysteine desulfhydrase activity producing H2S from cysteine. By screening of natural compounds for their ability to inhibit SaMccB activities on cysteine, EGCG, the main constituent in tea catechins, was found to inhibit MccB enzyme activity in H2S production. Notably, EGCG inhibited MccB by sequestering PLP, thus reducing the cytosolic pool of PLP by forming a hemi-acetal compound with free pyridoxal or pyridoxal phosphate. EGCG also reduced the H2S production in the SaMccB-overproducing bacteria and Staphylococcus aureus. Interestingly, EGCG could not inhibit the H2S production in the Lactobacillus plantarum, which indicating that EGCG's inhibitory effect on the production of hydrogen sulfide may be specific to certain strains, notably Staphylococcus aureus. The results shed light on a novel pathway through which EGCG regulates bacterial H2S production, and this finding may have potential applications in diets aimed at suppressing the antibiotic resistance of pathogens in gut using the edible compound EGCG.

황색포도상구균은 피리독살 인산-의존성 효소인 MccB를 통하여 황화수소를 생성하며 이는 병원균의 지속적인 생존력과 항생제 저항성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 황색포도상구균 MccB의 결정 구조 규명을 통하여 피리독살 인산이 존재하는 활성부위 주변에 반응에 관여하는 잔기들을 확인하였다. 이 잔기들의 돌연변이화에 의하여 MccB의 효소 활동이 없어짐을 확인하였으며 돌연변이 MccB 결정 구조가 MccB의 시스타티온 감마 라이에이즈 활성과 황화수소 생성 활성이 공통적으로 MccB의 활성 부위에 있는 잔기들에 의하여 촉매된다는 것을 보여주었다. 또한, MccB의 두가지 활성을 조사하고, MccB 단백질의 활성에 대한 천연물의 억제 효과를 탐색하였다. 정제된 황색포도상구균 MccB는 시스타티온에서 시스테인을 생산하는 시스타티온 감마 라이에이즈 활성과 시스테인으로부터 황화수소를 생성하는 활성을 나타내었다. 또한 천연물 스크리닝을 통하여 차 카테킨의 주 성분인 에피갈로카테킨 갈레이트가 MccB 단백질의 활성을 강력하게 억제함을 발견하였다. 에피갈로카테킨 갈레이트는 MccB의 보조인자인 피리독살 인산과 결합하여 헤미아세탈 구조를 이룸으로써 MccB를 억제하며, 이로 인해 세포질 내 자유 피리독살 인산 양이 줄어든다. 에피갈로카테킨 갈레이트는 또한 MccB 과발현 세균과 황색포도상구균에서 황화수소를 감소시켰다. 흥미롭게도, 락토바실러스 플란타럼에서의 황화수소 생산은 억제하지 못하였는데, 이는 에피갈로카테킨 갈레이트의 황화수소 생산에 대한 억제 효과가 특정 균주, 특히 황색포도상구균에 특정됨을 알 수 있다. 본 연구는 에피갈로카테킨 갈레이트가 세균의 황화수소 생산을 조절하는 새로운 경로에 대한 이해를 제공하며, 각종 차로 섭취 가능한 에피갈로카테킨 갈레이트가 황화수소로 인해 야기되는 장 내 염증과 대장암 발병을 억제함과 동시에 병원균의 항생제 내성을 줄일 수 있음을 시사한다.