In situ real-time monitoring of methicillin-resistant Staphylococcus aureus biofilm formation using Raman spectroscopy

Abstract

Recently, the prevalence of antimicrobial-resistant bacteria has been a critical challenge worldwide. Among the leading causes of infections is methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), which forms biofilms on polymeric medical devices and implants, increasing their resistance to antibiotics by 10–1,000-fold. It is critical to apply antibiotics before biofilm formation. To diagnose early stage MRSA biofilm formation, the Raman spectrum was measured from 0 h to 48 h. Biofilms of MRSA were cultivated and characterized on a newly developed brain heart infusion-sucrose agar platform using Raman spectroscopy. Biofilm formation could be monitored by measuring DNA/RNA-associated Raman peaks and protein/lipid-associated peaks. During the first 5 h of incubation, monosaccharides, the main ingredient of the medium, produced Raman signals at 495 cm−1. After 6–24 hours, 764, 1012, 1159, and 1526 cm−1 peaks correlated to DNA/RNA and carotenoids of biofilm increased, resulting in bacterial attachment and proliferation. During the 25–48 h of incubation, DNA/RNA-related signals decreased, and 1440–1460 cm−1 and 1630 cm−1 increased, reflecting the changes in lipids and proteins related to biofilm extracellular polymeric substances. Based on extensive Raman data, principal component analysis (PCA) classified three different stages of biofilm formation. Microscopy and the quantification of biofilm growth hourly confirmed early stage biofilm growth between 5 and 10 h of incubation time. To find the best time to efficiently eradicate MRSA biofilms, the antibacterial efficacy of Eugenol was applied at different hours. The monitored Raman spectrum showed that the most antibiotic susceptible time was found at the first 5 h of biofilm formation. Raman spectroscopy results were in good agreement with that from colony forming unit statistical analysis. According to these results, Raman spectroscopy can monitor biofilm formation in situ on solid culture medium and carry out rapid anti-biofilm tests by newly discovered antibiotics at the early stage of the process.

전 세계적으로 항균제 내성 박테리아의 확산은 중요한 도전 과제가 되었다. 메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA) 감염은 고분자 의료 기기 및 임플란트에 생물막을 형성하여 항생제에 대한 내성을 약 1,000배 가까이도 증가시킨다. 이러한 항생제 내성 및 생체막 형성 문제로 새로운 항균제와 대체요법이 시급하다. 특히, 항균제의 투여시간이 생물막 근절에 직접적인 영향이 있음이 밝혀져 효과적인 항균제를 적절한 생물막 성장 시기에 적용하는 것이 중요하다. 바이오필름이 생체 내 약물 내성 발달에 중요 하다는 점을 고려할 때, 바이오필름에 대한 약물의 효과를 평가하는 효과적인 방법이 필요하다. 이를 보완하기 위하여 MRSA 생물막의 성장과정을 모니터링하고 단계별 항균 효과를 측정하기 위하여 라만 분광법을 수행하였다. 라만 분광법은 레이저가 분자의 공명에 의해 산란되는 특성을 이용하여 세포 내 지질, 핵산, 단백질 등의 구성물질을 신속하게 측정할 수 있어 세균 검측에 적합한 기술로 알려져 있다. 세포 구성물질에 대한 높은 특이성과 민감성 때문에 라만 스펙트라(spectra)만으로 생리적 활성 변화에 대한 정량이나 정성 평가에 활용할 수 있다. 본 연구에서는 신속하게 라만 분광기로 균주 생물막의 성장을 정성 정량 분석하여 최적의 항균제 투여시기를 알아보는 플랫폼을 개발하고자 하였다. MRSA 생물막을 0시간에서 48시간 동안 라만 분광기로 측정하였다. MRSA 생물막 배양 첫 5시간 동안 배지의 주성분인 단당류는 495 cm-1에서 라만 신호를 생성했다. 6~24시간 후, DNA/RNA와 상관관계가 있는 764, 1012, 1159 및 1526 cm-1 피크가 증가하고 생물막의 케로티노이드가 증가하여 박테리아 부착 및 증식이 발생을 확인했다. 배양 25-48시간 동안 DNA/RNA 관련 신호는 감소하고 1440-1460 및 1630 cm-1이 증가하여 EPS의 변화가 일어남을 확인하였다. 생물막의 주성분 분석을 통하여 MRSA 성장의 3가지 다른 단계를 식별하였다. 48시간 동안 모니터링을 통하여 171개의 라만 스펙트럼을 얻을 수 있었다. 많은 데이터의 분류와 상관관계를 알아내기 위하여 다변량분석법(PCA, PLS-DA, PLSR)을 사용하여 바이오필름의 성장과정을 스테이지별로 구분 지어 봤다. 이 중 가장 항균 효과가 큰 시점을 찾기 위하여 생물막 감수성 확인을 라만 분광기로 수행하였다. 확인한 결과는 CFU(Colony Forming Unit) 결과로 효용성을 같이 입증하였습니다. MRSA 생물막의 항균 활성을 확인하기 위하여 항균제 감수성 검사를 통하여 총 11개의 생약성분 중 유제놀의 유의미한 항균효과를 확인하였다. 기존에는 유제놀에 대한 일부 약효에 대한 연구는 있었으나 실제 임상 균주의 생물막을 대상으로 한 연구결과는 아직까지 없다. 생물막 억제 과정을 확인하기 위하여 유제놀을 항균제로 선정하였다. 유제놀은 정향(Caryophilli Flos, Myrtaceae)의 주성분으로 현재 국소마취제로 이용되거나, 자궁수축, 항진균, 항바이러스 효과 억제한다는 보고가 있다. 이러한 항균효과를 실시간으로 확인하기 위하여 MRSA 생물막에 대한 라만 분석을 수행하였다. 라만분광법은 세포의 생화학적 변화를 정량적, 비표지 그리고 빠른 모니터링을 할 수 있어 실행되었다. Petrifilm으로 바이오필름의 성장 단계 별 투여한 유제놀과 반코마이신의 효과를 CFU 값으로 확인하였다. MIC 농도의 반코마이신보다 MIC 유제놀이 약 15프로 이상 높은 바이오필름 제거 효과를 확인하였다. MIC의 2배농도인 MBIC 농도의 유제놀은 대조군의 약 50프로 이상의 제거 효과를 생물막 초기단계에서 보여주었다. 이는 라만 분석과 CFU 계산 결과와 일치하였다. 이 결과에 따르면 라만 분광법을 활용하여 생물막 형성을 모니터링하여 신속한 천연물 유래 항균 효과를 탐색 가능할 것으로 보여진다. 앞으로 라만 분광기를 활용한 새로운 천연 항균제의 개발이 가능할 것으로 생각된다.