Comprehensive analysis of breast phyllodes tumor using next-generation sequencing and patient-derived xenograft model

Abstract

유방 엽상종양 (phyllodes tumors of the breast)은 상피 (epithelial) 조직 성분과 기질 (stromal) 조직 성분을 모두 가지고 있는 독특한 이상성 신생물 (biphasic neoplasms)이며, 섬유선종 (fibroadenoma)과 함께 섬유상피성 종양 (fibroepithelial tumor)에 속해 있다. 유방 엽상종양은 유방의 수유관 (milk duct)에서 유래되는 침윤성 유관암 (invasive ductal carcinoma, IDC)과는 다르게 결합조직에서 종양이 시작되는 것으로 알려져 있다. 유방 엽상종양은 드물게 나타나는 종양으로서, 전체 유방암 중에서 매우 적은 비중을 차지하고 있다. 엽상종양은 WHO에 의해서 정해진 여러 조직학적인 특성과 관련된 기준에 따라서 양성 (benign), 경계성 (borderline), 악성 (malignant)으로 분류되어지는데 악성 종양의 경우는 엽상종양 중에서도 드물게 나타난다. 악성 엽상종양 (malignant phyllodes tumor, MPT)은 비교적 높은 재발율에도 불구하고 현재 시행되는 치료 전략은 제한적이다. 엽상종양의 재발을 막기 위해 종양의 넓은 범위를 절제하는 수술이 현재 엽상 종양에 대해서 주로 사용되고 있는 치료법이다. 이러한 엽상 종양에 대한 효과적인 치료 전략의 부족은 종양의 희소성, 분자적인 특성에 대한 이해 부족, 적합한 연구 모델의 부재에서 기인된 것으로 보인다. 따라서, 우리는 이 연구를 통해서 악성 엽상종양의 분자적인 특성에 대한 이해를 높이고, 적합한 연구 모델 발굴과 함께 효과적인 치료 전략들을 찾고자 하였다. 우리는 악성 엽상종양 환자 9명으로부터 얻은 종양 조직에 대해 DNA 염기서열분석 (sequencing)과 RNA 염기서열분석을 수행하였다. 이렇게 만들어진 악성 엽상종양의 염기서열분석 데이터는 연구실 내부 (in-house)에 있던 침윤성 유관암과 정상 유방 조직에 대한 염기서열분석 데이터와의 비교 분석이 수행되어졌다. 또한, 우리는 한 명의 악성 엽상종양 환자로부터 얻은 종양을 이용해 악성 엽상종양에 대한 환자 유래 이종이식 모델 (patient-derived xenograft model, PDX)을 성공적으로 수립하였다. 악성 엽상종양에 대한 전장 엑솜 염기서열분석 (whole exome sequencing, WES) 데이터를 통해서 악성 엽상종양은 침윤성 유관암에 비해서 종양 변이 부하 (tumor mutation burden, TMB)가 비교적 낮게 나타나는 것을 관찰하였다. 또한, 악성 엽상종양에서의 변이 시그니처 (mutational signature) 분석을 통해서 시그니처 1과 관련된 C>T 변이의 빈도가 높은 반면에, 유방암에서 흔히 발견되는 시그니처 3이나 APOBEC과 관련된 변이 시그니처인 시그니처 2와 13이 악성 엽상종양에서는 빈도가 낮은 것을 관찰하였다. 그리고 악성 엽상종양과 침윤성 유관암의 전사체 분석 데이터 비교를 통해서 악성 엽상종양과 침윤성 유관암이 다른 유전자 발현 패턴을 보이는 것을 관찰하였다. 우리는 악성 엽상종양에서 여러 암 관련 유전자들의 체세포 변이를 발견하였는데, 그 중에서 섬유상피성 종양에서 빈번하게 발생한다고 알려져 있는 MED12 유전자에서의 체세포 변이를 9개의 샘플 중에서 4 샘플에서 관찰하였다. 또한, 이전에 다른 연구팀에 의해 수행된 엽상종양 연구에서도 관찰되었던 PDGFRB 유전자의 N666K 체세포 변이를 우리 코호트에서도 관찰하였다. RNA 염기서열분석 데이터를 통해서 우리는 정상 유방 조직이나 침윤성 유관암에 비해서 악성 엽상종양에서 PDGFRB 유전자의 발현양이 높으며, PI3K-Akt 경로 (pathway)가 상향조절 (upregulation)되어 있음을 관찰하였다. 이에 따라, 악성 엽상종양 환자 유래 이종이식 모델에 PDGFR를 겨냥하는 저해제인 이매티닙 메실레이트 (imatinib mesylate)와 PI3K를 겨냥하는 저해제인 PKI-587을 투여하였을 때, 엽상종양이 두 저해제에 모두 반응하면서 종양의 성장율이 대조군에 비해서 감소하는 것을 발견하였다. 우리가 수립한 악성 엽상종양 환자 유래 이종이식 모델에 대한 전사체 데이터 분석을 통해서 악성 엽상종양 환자 유래 이종이식 모델에 있는 인간 세포와 쥐 세포의 전사체 데이터를 분리해서 관찰해 보았을 때, 인간 세포에는 간질 세포가 풍부한 반면에 쥐 세포에는 상피 세포가 풍부한 것을 관찰하였다. 그리고 이러한 악성 엽상종양 환자 유래 이종이식 모델에 있는 상피 부분이 종양이 성장하면서 증가하는 것을 관찰하였다. 마지막으로 악성 엽상종양에 대한 RNA 염기서열분석 데이터를 통해서 우리는 악성 엽상종양 샘플들이 두 개의 그룹으로 나누어지는 것을 발견하였다. 우리는 상피세포 관련된 유전자들의 발현이 높은 샘플들이 속해 있는 그룹을 상피 (Epithelial) 그룹으로, 기질세포 관련된 유전자들의 발현이 높은 샘플들이 속해 있는 그룹을 섬유질 (Fibrous) 그룹으로 명명하였다. 그리고 우리는 두 개의 악성 엽상종양의 분자적인 그룹들 (상피 그룹과 섬유질 그룹) 사이에서 유전자 발현양이 차이나는 유전자들 (differentially expressed genes, DEGs)로부터 악성 엽상종양 샘플들을 두 개의 그룹으로 분류할 수 있는 32개의 유전자들로 이루어진 유전자 발현 시그니처를 개발했다. 우리는 또한 상피 그룹이 섬유질 그룹에 비해서 MED12 유전자 변이의 빈도가 더 높으며, PDGFRB 유전자의 발현양이 낮은 것을 관찰하였다. 결론적으로, 우리는 이 연구에서 악성 엽상종양에 대한 환자 유래 이종이식 모델 수립과 차세대 염기서열 분석 기술을 통해서 악성 엽상종양을 폭넓게 이해할 수 있는 기회를 얻었다. 우리는 악성 엽상종양에 대한 유전체와 전사체 분석을 통해서 악성 엽상종양이 암종 (carcinoma)과는 다른 독특한 분자적인 특성을 가지고 있는 것을 관찰하였으며, 임상적으로 의미 있을 수 있는 악성 엽상종양의 분자적인 그룹들을 드러냈다. 그리고 PDGFR과 PI3K 경로를 표적으로 하는 악성 엽상종양에 대한 효과적이며 새로운 치료 전략들을 제시하였다. 또한, 이 연구는 상피 부분과 기질 부분으로 이루어진 섬유상피성 신생물 (fibroepithelial neoplasms)에서의 상피와 기질 각각의 역할을 환자 유래 이종이식 모델과 차세대 염기서열 분석 기술을 이용하는 우리 지식으로는 기존에 시도된 적 없었던 새로운 접근법을 통해서 보여주었다. 이로써, 환자 유래 이종이식 모델이 악성 엽상종양에 대한 약물 스크리닝을 위한 전임상 모델과 섬유상피성 신생물 연구를 위한 적절한 연구 모델이 될 수 있음을 제시한다.

Breast phyllodes tumors are unique neoplasms that have both epithelial and stromal components. Phyllodes tumors of the breast are rare tumors that account for a very low proportion of all breast cancers. Phyllodes tumors are classified into benign, borderline, and malignant according to established criteria. Malignant phyllodes tumors (MPT) are very uncommon tumors that occupy a low proportion among phyllodes tumors. Despite the relatively high recurrence rate in MPT, therapeutic strategies are limited. Current treatment for phyllodes tumors is mainly surgery. This lack of treatment options is due to the rarity of tumors, a lack of understanding of molecular characteristics, and lack of appropriate research models. We conducted this study to find other effective therapeutic strategies applicable to MPT. We were able to perform DNA sequencing and RNA sequencing using tumor tissues obtained from nine patients with MPT. Comparative analysis was performed using in-house sequencing data for invasive ductal carcinoma (IDC) and normal breast tissue. In addition, we were able to successfully establish a patient-derived xenograft (PDX) mouse model using one MPT tissues. Through whole exome sequencing data analysis of MPT, it was observed that the tumor mutations burden was low and the frequency of C>T mutation related to mutational signature 1 was high. We found several somatic mutations in cancer-related genes. Mutations in the mediator complex subunit 12 (MED12) gene, known to occur frequently in phyllodes tumors, were also found in 4 samples in our cohort. We also found the N666K mutation in the platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFRB) gene, which was previously observed in studies related to phyllodes tumors and infantile myofibromatosis. Through RNA sequencing data analysis, we observed that the PDGFRB gene expression was higher and the phosphoinositide 3-kinase (PI3K)-Akt pathway was upregulated in MPT compared to normal breast tissue and IDC. Accordingly, when drugs targeting PDGFR and PI3K pathways were administered to the PDX mouse model derived from MPT, it was found that the tumor growth rate was reduced compared to the control group. Through transcriptome data analysis of our established MPT PDX, we observed that stromal cells were enriched in human cells of MPT PDX, whereas epithelial cells were enriched in mouse cells. In addition, it was observed that the epithelium in MPT PDX increased as the tumor grew. Finally, through analysis of RNA sequencing data for MPTs, we found that MPT samples were divided into two groups. Furthermore, we developed a gene expression signature consisting of 32 genes that can classify MPT samples into two subgroups. One group of MPT was named the Epithelial group because of the high expression of epithelial cell-related genes, and the other group was named the Fibrous group because of the high expression of stromal cell-related genes. We observed that the Epithelial group had a higher frequency of MED12 mutation and a lower expression of the PDGFRB gene than the Fibrous group. In conclusion, in this study, we had the opportunity to broadly understand MPT through the establishment of the PDX mouse model and the analysis of next-generation sequencing (NGS) data for MPT. We identified unique molecular characteristics of MPT different from carcinoma. We presented new therapeutic strategies targeting PDGFR and PI3K/mammalian target of rapamycin (mTOR) that are effective against MPT, showed the respective roles of epithelial and stromal elements in fibroepithelial neoplasms consisting of epithelial and stromal elements, and revealed the molecular subgroups of MPT that may have clinical significance. Finally, in this study, we suggest the possibility of PDX model as a research model for understanding the pathogenesis of MPT as well as a preclinical model for drug screening.