Development of an efficient detection method for monoclonal protein using MALDI-TOF mass spectrometry

Abstract

Abstract

Introduction: Monoclonal protein (M-protein) is an abnormal increase of monoclonal protein found in the bloodstream that is produced by one or more clonal cells in patients with plasma cell disorders (PCDs) such as multiple myeloma (MM), monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS), and solitary plasmacytoma. Protein electrophoresis (PEP), immunoelectrophoresis (IEP), and immunofixation electrophoresis (IFE) are usually performed to evaluate the presence of M-protein for diagnosis and monitoring disease status. Recently, detection methods based on mass spectrometry (MS) are emerging as highly sensitive for detecting M-protein in smaller amounts. The aim of this study is to develop and evaluate efficient method for screening and detecting monoclonal protein using mass spectrometry in a clinical laboratory. Methods: Residual samples were used after performing routine tests at Seoul National University Hospital (SNUH). Based on IFE results, normal serum and abnormal serum samples including different subtypes of M protein were selected. Different sample preparation techniques were performed for optimizing the method. Nanobody affinity beads (NB), Melon IgG purification spin kit with C4 ZIPTIP and Magnetic beads (MB) consisting of IgG were used for separation of immunoglobulins. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) MS (Bruker Daltonics, Germany) was performed to detect and analyze the samples. High sensitive resolution MS, liquid chromatography combined with Synapt G2 quadrupole time-of-flight (qTOF) mass spectrometer MS (Waters, U.K.), was performed and compared to confirm the m/z difference occurs in MALDI-TOF MS. For analytical performance, precision of m/z values and limit of detection (LoD) was evaluated. MALDI-TOF MS combined with NB serum preparation (NB-MALDI-TOF) was performed for twenty-five normal and twenty-five abnormal IFE samples. Results: Reduced light chains were observable as a peak at a certain mass-to-charge ratio (m/z ratio) range in the mass spectrum. A single charged light chain peak at 22,000 to 24,500 Da, while double charged light chain was observed at 11,000 to 12,500 Da. A single charged heavy chain peak was observed at 50,000 Da, and a double charged heavy chain peak was observed at 25,000 Da. Monoclonal peaks were observed in abnormal samples, while polyclonal peak was observed in normal ones. Comparing three methods for IgG purification, NB showed the lowest LoD value at 0.1 g/dL. In MALDI-TOF MS combined with NB serum preparation (NB-MALDI-TOF) method, results showed 92% concordance with IFE results among fifty samples. NB-MALDI-TOF showed 92% sensitivity and 92% specificity. Conclusions: In conclusion, NB-MALDI-TOF method was sensitive and useful as a qualitative method to detect M-protein in addition to IFE. NB-MALDI-TOF might be helpful to identify M-protein in false negative IFE or confirm ambiguous result of IFE.

Keyword: Multiple myeloma, Paraproteinemias, M-protein, Matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry Student Number: 2019-26416

국문초록

서론: 단세포성 면역글로불린(단클론성 단백, M-단백)은 다발성골수종과 같은 형질세포질환에서 증가 소견이 관찰되며, 질병 활성도를 반영하는 것으로 알려져 있다. M-단백 검출을 위하여 기존의 검사 방법으로 단백전기영동검사(protein electrophoresis, PEP), 면역전기영동법(immuno-electrophoresis, IEP), 그리고 면역고정 전기영동법(immunofixation electrophoresis, IFE)의 검사를 시행한다. 최근 단클론성항체를 치료제의 사용으로, 소량의 M-단백이 남아 있는 미세잔존질환(minimal residual disease, MRD)에 대해 관심이 높아지고 있다. 질량분석기를 기반으로 M-단백을 검사하는 방법은 소량의 M-단백도 측정할 수 있는 민감도가 높은 방법으로, 임상적으로 질량분석기를 이용한 검사 가능성이 대두되고 있다. 이에 질량분석기를 이용하여 혈청 내에 존재하는 M-단백을 검출하고자 하였다. 방법: 서울대학교병원에서 IFE 검사를 요청한 환자를 대상으로, 요청된 검사를 시행 후 잔여 검체를 사용하였다. 잔여 약제인 다라투무맙(daratumumab)과 세툭시맙(cetuximab)을 사용하였다. 해당 약제는 기존에 아미노산 서열과 분자량이 알려진 단클론성약제로, 고분해능 질량분석기로 분자량을 확인하여 MALDI-TOF 결과와 비교하였다. 전처리 방법으로 Captureselect nanobody affinity beads (NB)를 사용하여 IgG, IgM, IgA, kappa and lambda (KnL), kappa, lambda로 분리하였고, Melon spin gel kit와 magnetic beads (MB) 방법으로 IgG 정제를 시행하였다. 위 세가지 방법으로 전처리를 시행한 검체는 a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) matrix를 사용하여 1 µL씩 도포하였고, 말디토프 질량분석기(matrix-assisted laser desorption/Ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)로 측정 및 분석을 시행하였다. IFE 양성 25건, IFE 음성 25건의 환자 검체를 대상으로, NB 전처리 후 MALDI-TOF (NB-MALDI-TOF) 검사를 진행하였다. 결과: 검사 결과의 해석은 질량 스펙트럼에서 관찰되는 경쇄의 질량대전하비를 확인하였다. 2가의 경쇄는 11,000-12,500 Da, 1가의 경쇄는 22,000-24,500 Da의 질량 대 전하비를 보였다. 2가의 중쇄는 약 25,000 Da, 1가의 중쇄는 대략 50,000 Da 정도의 질량 대 전하비를 보였다. 정상의 경우 polyclonal peak가 관찰되는 반면, 비정상의 경우 monoclonal peak가 관찰되었다. NB로 전처리한 경우, 검출 한계가 0.1 g/dL로 가장 낮았다. Melon spin gel kit를 사용한 방법은 0.2 – 0.5 g/dL의 검출 한계를 보였고, MB 방법은 0.5 g/dL였다. NB-MALDI-TOF 결과 상 양성 23건, 음성 23건으로 확인되어, IFE 검사와 92% 의 일치도를 보였다. NB-MALDI-TOF 검사의 민감도와 특이도는 각각 92%, 92% 였다. 결론: NB-MALDI-TOF 검사법은 민감도가 높은 검사법으로 확인되었다. IFE 검사에 추가적으로 NB-MALDI-TOF 검사를 시행하는 경우, 정성검사로써 소량의 M단백 검출에 유용할 것으로 사료된다. 특히, IFE 결과가 음성이거나 판단하기가 어려운 경우에 M단백을 검출하는데 도움이 될 수 있을 것이다.

주요단어: 다발골수종, 형질세포질질환, 단세포군감마글로불린병증, 단클론성 단백, 말디토프 질량분석법 학번: 2019-26416