Evaluation of Radiation Sensitivity Differences in Mouse Liver Tumor Organoids using CRISPR/Cas9-mediated Gene Mutation

Abstract

As the development of cancer treatment, organoids have recently been used in various research fields. The creation of tumor organoid models through specific genetic mutations is opening up new horizons in patient care. In this study, to assess the radiation sensitivity of liver tumors harboring different genetic mutations, mouse liver tumors were generated in vivo through the hydrodynamic injection of clustered regularly interspaced short palindromic repeat/caspase 9 (CRISPR/Cas9) constructs encoding single-guide RNAs (sgRNAs) targeting Tp53, Pten, Nf1, Nf2, Tsc2, Cdkn2a, or Rb1. The plasmid vectors were delivered via hydrodynamic tail vein injection to the liver of adult C57BL/6 male mice. The vectors were injected into 10 mice in each group. Organoids were generated from mouse liver tumors. The radiation response of the organoids was assessed using an ATP cell viability assay. The mean survival period of mice injected with vectors targeting Nf2 (4.8 months) was lower than that of other mice. Hematoxylin and eosin staining, immunohistochemical (IHC) staining, and target sequencing analyses revealed that mouse liver tumors harbored the expected mutations. Tumor organoids were established from mouse liver tumors. Histological evaluation revealed marked morphological similarities between the mouse liver tumors and the generated tumor organoids. Moreover, IHC staining indicated that the parental tumor protein expression pattern was maintained in the organoids. The results of the ATP cell viability assay revealed that the tumor organoids with mutated Nf2 were more resistant to high-dose radiation than those with other gene mutations. In this study, a radiation response evaluation system for mouse tumors with mutation target genes was developed using CRISPR/Cas9 and organoids. The Tp53 and Pten double mutation in combination with the Nf2 mutation increased the radiation resistance of tumors. The system used in this study can aid in elucidating the mechanism underlying differential intrinsic radiation sensitivity of individual tumors. In the future, it can be considered as a method for predicting radiation therapy responsiveness according to genetic mutations of individual liver tumors in advance.

암 치료법의 개발로서 오가노이드는 최근 다양한 연구 분야에서 사용되고 있다. 특정 유전자 변이를 통한 암 오가노이드 모델의 생성은 환자 치료에 있어 새로운 지평선을 열어주고 있다. 본 연구에서는 다양한 유전적 돌연변이가 있는 간 종양의 방사선 반응성 탐색을 위해 Tp53, Pten, Nf1, Nf2, Tsc2, Cdkn2a, 또는 Rb1 유전자를 타겟으로 하는 Single-guide RNA를 이용한 크리스퍼 유전자 가위의 hydrodynamic injection을 통해 마우스 간 종양을 생성, 방사선 조사에 따른 반응성을 탐색하였다. 플라스미드 벡터는 성체 C57BL/6 마우스의 꼬리에 hydrodynamic injection을 통해 주입되었다. 각 그룹별 총 10마리의 마우스에 주입하였다. 이 그룹 중 간 종양이 확인된 마우스를 대상으로 오가노이드를 생성하였다. 오가노이드에 대한 방사선 반응성은 ATP 세포 생존 방법을 통해 평가하였다. Nf2 유전자를 타겟으로 하는 마우스의 생존기간이 (4.8개월) 다른 마우스 군에 비해 짧은 것으로 나타났다. 헤마톡실린-에오신 염색, 면역조직화학염색, 타겟 염기서열분석에서 마우스 간 종양이 예측된 유전자 변이를 보이는 것이 확인되었다. 이러한 마우스 간 종양을 통해 각 군별 오가노이드를 구축하였다. 조직학적 분석에서 마우스 간 종양과 생성된 종양 오가노이드 사이에는 비슷한 형태학적 유사성을 보여주었다. 추가로 면역조직화학 염색에서도 마우스 간 종양과 오가노이드가 동일한 염색 패턴이 유지됨을 확인하였다. ATP 세포 생존 분석에서는 다른 변이 대비 Nf2 유전자 변이가 이뤄진 간 종양 오가노이드가 고선량 방사선에 저항성을 보이는 것이 확인되었다. 본 연구에서는 크리스퍼 유전자 가위를 이용, 마우스 간 종양 생성을 통해 특정 유전자의 변이가 가능함을 확인하였으며 마우스 간 종양 오가노이드의 방사선 조사량에 따른 반응을 탐색할 수 있었다. 특히 Tp53, Pten 그리고 Nf2 유전자의 동시 변화가 이뤄진 오가노이드의 경우 방사선 저항성이 증대됨을 확인하였다. 이러한 시스템은 향후 개별 간 종양의 유전자 변이에 따른 방사선 치료 반응성을 미리 예측할 수 있는 방법으로 고려될 수 있다.