Evaluation on erythrocyte preservation performance, plasticizer leaching, and clinical feasibility of DINCH as a substitute for phthalate plasticizer in blood bags

Abstract

배경: Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)는 polyvinyl chloride (PVC)를 유연하고 신축성이 있는 물질로 변환하기 위해 혈액백의 제조 시 흔하게 사용되는 가소제이다. DEHP는 적혈구의 안정성 향상에 기여하고 용혈률을 감소시켜 보존 기간을 늘려주는 성질을 가지고 있다. 그러나 생식기계 독성 및 내분비계 교란과 관련된 DEHP의 위험성에 대해 많은 우려가 수년간 제기되어 왔다. DEHP는 PVC에 공유결합되어 있지 않기 때문에 PVC 제품의 내용물이나 그 주변 환경으로 용출되어 나올 수 있다. 이러한 특성으로 인해 사람과 동물은 다양한 경로로 DEHP에 노출될 수 있다. DEHP 독성에 대한 증거는 대부분 동물 모델에서 발견되었으며, 인간에서의 직접적인 독성은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다. 그러나 혈액제제 수혈과 같은 특정 치료를 받는 환자들은 고농도의 DEHP에 노출될 우려가 있다. 적혈구 보존을 위한 혈액백에서 DEHP 대체재에 대해 몇몇 연구가 시행된 바 있으나, 다양한 혈액제제 생산 조건에서의 DEHP 대체재에 대해 충분한 연구 결과가 축적되어 있지 않다. Di(isononyl) cyclohexane-1,2-dicarboxylate (DINCH)는 우수한 독성학적 성질을 지닌 대체 가소제로, DINCH-PVC는 DEHP-PVC와 유사한 기계적 및 물리학적 특성을 가지고 있다. 본 연구에서는, citrate phosphate dextrose adenine (CPDA-1) 항응고제 하에서 DEHP의 대체제로 DINCH를 사용한 혈액백의 적혈구 보존 성능을 평가하고, DEHP와 DINCH 농도를 측정할 수 있는 고성능액체크로마토그래피-탠덤질량분석기 검사법을 개발하여 혈액백에서의 가소제 농도를 측정하는 것을 목표로 하였다.

방법: Pool-and-split 방법의 연구 설계를 이용하여, CPDA-1 항응고제와 혼합된 균질한 성상의 혈액을 2개의 DINCH 혈액백과 3개의 DEHP 혈액백에 나누어 농축적혈구를 생산할 수 있었다. 이렇게 짝지어진 5개의 농축적혈구를 총 20그룹 생산하였으며, 35일동안 보관하면서 매주 in vitro 실험실 검사를 시행하여 적혈구 보존 품질과 가소제 농도를 평가하였다. DEHP와 DINCH 측정용 검체는 액체-액체 추출 후 N2 내에서 30분간 건조시키고, 70% 메탄올과 0.1% 포름산으로 재부유시켰다. 이후 Synergi trap 및 BEH column이 장착된 고성능액체크로마토그래피 기기에 검체를 주입하고, m/z 391 → 149 (DEHP) 및 m/z 425 → 281 (DINCH)와 같은 다중반응모니터링 조건 하에서 삼중 사중극자 질량분석기로 검사하였다.

결과: 35일째 DINCH 혈액백에서의 용혈률 중앙값(DINCH-GCMS, 0.297%; DINCH-TC, 0.342%)은 DEHP 혈액백(DEHP-FK, 0.204%; DEHP-GCMS, 0.240%; DEHP-TC, 0.222%)보다 증가되어 있었으나(P < 0.05), 모든 개별 혈액제제에서의 용혈률은 0.8% 미만이었다. 혈색소, 적혈구용적률, 세포 수(적혈구, 백혈구, 혈소판)는 DINCH 혈액백에 비해 DEHP-FK 혈액백에서 증가되어 있었다. DINCH 혈액백에 보관된 적혈구는 DEHP 혈액백에 비해 평균적혈구용적은 증가되어 있었으며, 평균적혈구혈색소농도와 eosin-5-maleimide 결합성은 감소되어 있었다. DINCH 혈액백은 DEHP 혈액백보다 산소분압이 높고 이산화탄소분압이 낮아 우수한 기체투과도를 보여주었다. 적혈구대사와 관련된 다른 수치는 두 종류의 혈액백 사이에 비슷한 성질을 보여주었다. 검사차례내 정밀도는 DEHP와 DINCH 측정에 대해 각각 11.11–14.01% 및 2.08–6.15%로 확인되었다. DEHP와 DINCH 측정 시 각각 1–20 mg/L 및 0.0625–1.0 mg/L 범위에서 유의한 직선성을 보여주었다(DEHP, R2 = 0.9994; DINCH, R2 = 0.9993). Synergi trap column은 이동상에서의 DEHP 오염을 성공적으로 분리해낼 수 있었다. 농축적혈구 보관 35일째 DEHP와 DINCH 혈액백에서의 가소제 농도 중앙값은 각각 37.1–58.9 mg/L 및 0.89–1.22 mg/L 범위로 증가하였다.

결론: CPDA-1 항응고제 하에서 35일동안 보관된 DINCH 혈액백에서의 적혈구 품질은 DEHP 혈액백과 비교하여 뒤쳐지지 않는 수준을 보여주었다. 고성능액체크로마토그래피-탠덤질량분석기를 이용한 DEHP 및 DINCH 측정 검사법을 성공적으로 개발할 수 있었으며, 농축적혈구 보관 중 DEHP보다 DINCH가 느린 속도로 혈액 내로 유출됨을 확인할 수 있었다. DINCH는 혈액백 제조 시 차세대 적혈구 보존제를 사용하지 않는 조건 하에서도 DEHP를 대체할 수 있는 유망한 가소제라 평가할 수 있다.

Background: Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) is a plasticizer commonly used in blood bags to convert polyvinyl chloride (PVC) into a flexible and elastic material. DEHP enhances red blood cell (RBC) stability during storage and prolongs its shelf-life by decreasing hemolysis. However, concerns about DEHP-related reproductive toxicity and potential endocrine dysfunction have been debated for many years. DEHP can leach out from the material to its content or surroundings because it is not covalently bound to PVC. Because of this characteristic, humans and animals can be easily exposed to DEHP through various routes. Evidence of DEHP toxicity has been mostly found in animal models, and direct toxicity in humans is still unclear. However, patients undergoing certain clinical procedures, such as blood transfusion, can be at risk of high DEHP exposure. Several previous studies have investigated potential substitutes for DEHP in blood bags for RBC storage, but there is not enough data on the validation of non-DEHP systems in diverse settings. Di(isononyl) cyclohexane-1,2-dicarboxylate (DINCH) is an alternative plasticizer with a good toxicology profile, and DINCH-PVC has similar mechanical and physical properties to DEHP-PVC. This study aims to investigate the in vitro quality of RBCs stored in DINCH-plasticized blood bags with citrate phosphate dextrose adenine (CPDA-1) anticoagulant solution, develop an assay to measure DEHP and DINCH concentrations using ultra-high-performance liquid chromatography (UHPLC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), and analyze the plasticizer levels in blood bags.

Methods: Using a pool-and-split study design, we produced 20 matched homogenous quintets of RBC concentrates in two DINCH bags and three DEHP bags with CPDA-1 anticoagulant. RBC storage quality and plasticizer concentrations were assessed weekly for 35 days by performing a panel of in vitro tests. Samples for DEHP and DINCH measurement were prepared by liquid-liquid extraction, evaporation in N2 for 30 min, and resuspension in 70% methanol with 0.1% formic acid. Samples were loaded into a UHPLC system equipped with the Synergi trap and BEH columns, and multiple reaction monitoring transitions such as m/z 391 → 149 (DEHP) and m/z 425 → 281 (DINCH) were used for triple quadrupole MS/MS.

Results: On day 35, the median hemolysis levels in the DINCH bags (DINCH-GCMS, 0.297%; DINCH-TC, 0.342%) were marginally higher (P < 0.05) than the DEHP bags (DEHP-FK, 0.204%; DEHP-GCMS, 0.240%; DEHP-TC, 0.222%). However, all individual DINCH bags showed < 0.8% hemolysis. The DEHP-FK bag showed higher hemoglobin, hematocrit, and cell counts (RBC, white blood cell, platelet) than DINCH bags. RBCs in the DINCH bags showed increased mean corpuscular volume and decreased mean corpuscular hemoglobin concentration and eosin-5-maleimide binding than the DEHP bags. Higher pO2 and lower pCO2 levels in the DINCH bags indicated better gas permeability than in DEHP bags. Other metabolic parameters were comparable in both bags. The within-run imprecision for DEHP and DINCH measurement were 11.11–14.01% and 2.08–6.15%, respectively. Calibration curves were linear over a range of 1–20 mg/L for DEHP (R2 = 0.9994) and 0.0625–1.0 mg/L for DINCH (R2 = 0.9993). The Synergi trap column was successful in separating the DEHP contamination in the mobile phase. The median plasticizer levels of the blood bags on day 35 increased to a range of 37.1–58.9 mg/L (DEHP) and 0.89–1.22 mg/L (DINCH).

Conclusions: The quality of RBCs stored for 35 days in DINCH-plasticized blood bags with CDPA-1 is comparable to those in DEHP bags. We successfully developed a UHPLC-MS/MS assay to measure DEHP and DINCH concentrations in blood samples. DINCH leaches at a much slower rate into blood than DEHP during storage. Hence, DINCH is a promising alternative to DEHP in blood bags for RBC storage, even without the use of next-generation additive solutions to improve RBC preservation quality.