MICROWELL-BASED QUANTITATIVE GENE EXPRESSION ANALYSIS FOR SINGLE-CELL APPLICATIONS

Abstract

본 논문에서는 단일 세포 유전자 발현의 정량분석을 위한 다중적 부피를 갖는 미세우물구조 기반의 접근법을 제안하고 이를 구현한다. 세포는 모든 살아있는 생명체의 구조적, 기능적인 가장 기본적인 단위로서 다양하고 복잡한 생명현상의 본질을 이해하기 위한 가장 기초적인 요소이다. 수많은 복잡한 생명현상들이 세포들의 기작 및 세포간 혹은 세포와 외부 환경간의 상호작용에 의해 이루어지는 데 반해, 분자 생물학 및 세포 생물학 분야의 대부분의 연구는 수많은 세포들의 집단적인 평균적 겉보기 활동에 대한 관찰 및 해석에 의해 이루어져 왔다. 이는 기존의 전통적인 세포 분석 방법들의 기술적 수준의 한계에 따른 것인데, 세포의 생명활동과 관련하는 여러 가지 현상에 대한 보다 정확한 관찰 및 분석이 요구됨에 따라 기존에 이루어져 왔던 연구 방법들을 단일 세포 단위로 접근할 수 있는 진보된 기술의 필요성이 점차적으로 증가하고 있다. 다양한 종류의 분자 생물학적 분석법 가운데 본 연구에서는 유전자 정량 분석에 주목하였다. 유전자 세포 내 유전자 발현량은 세포의 기능적 활동을 결정짓는 단백질 발현과 직접적인 관련성을 가지기 때문에 세포의 생명 현상적 상태를 파악 하는 데에 주요 지표로 활용될 수 있다. 또한 하나의 생명체를 이루는 수많은 세포들이 거의 동일한 유전체 정보를 가지는 데에 반해 유전자 발현량은 내∙외부적 환경에 따라 세포마다 다르게 나타나기 때문에 단일 세포 단위의 분석이 특히 요구된다. 최근 반도체 미세 공정 및 바이오칩 기술이 발전함에 따라 기존의 유전자 정량 분석법들로는 수행하기가 어려웠던 단일 세포 단위의 유전자 정량분석의 가능성을 높이는 기술들이 조금씩 개발되고 있다. 본 논문에서는 미세우물구조를 기반으로 하는 단일 세포 유전자 정량 기술의 개발에 대한 연구를 진행하였다. 즉, 각 미세우물구조 안에 단 하나의 세포만이 들어가게끔 유도한 후 미세우물구조들을 공간적으로 분리시킴으로써 수많은 독립적인 유전자 정량 반응을 병렬적으로 얻어내는 기술에 대하여 연구하였다. 미세우물구조 기반의 단일 세포 유전자 정량 분석을 이루어 내기에 앞서 두 가지 기술적인 어려움이 우선적으로 극복되었다. 우선 미세유체소자 기반의 유전자 정량 분석 환경을 구축하였다. 수많은 미세우물구조를 포함하는 미세유체소자를 제작하고, 미세유체 환경에서 유전자 증폭 반응을 성공적으로 재현하였다. 또한 유전자 정량 분석을 수행할 수 있는 실시간 유전자 증폭 분석계를 구현하였다. 다음으로 세포의 분쇄과정과 유전자 역전사 및 증폭과정이 단일 반응공간에서 연속적으로 이루어질 수 있는 시약 조성을 확보하였다. 별도의 유전자 추출과정 없이 세포를 반응에 첨가 하였을 때 유전자 역전사 및 증폭과정에 관여하는 효소 등의 기능을 손상시키지 않으면서 세포로부터 유전자 전사물을 획득하는 시약 조건을 확립함으로써 여러 단계에 걸쳐 이루어지는 세포 내 유전자 증폭 과정을 단일 반응공간에서 이루어 내었다. 단일 세포로부터의 유전자 획득 및 증폭이 안정적으로 이루어질 수 있는 반응 환경을 구축하기 위하여 서로 다른 부피를 갖는 두 미세우물구조를 하나로 합치는 방식의 접근법을 고안하여 연구를 진행하였다. 즉, 단일 세포와 비슷한 크기를 갖는 미세우물구조를 준비하여 단일 세포들을 가둔 후에 더 큰 부피를 갖는 미세우물구조와 대응시켜 결합함으로써 각각의 단일 세포들이 필요로 하는 부피의 반응 조건에 노출될 수 있도록 유도하였다. 이와 같은 미세우물구조 기반의 단일 세포 배치 방법을 미세유체환경의 실시간 유전자 증폭 분석법 및 단일 반응공간 세포 유전자 증폭 조건과 결합함으로써 하나의 미세유체소자에서 병렬적인 단일 세포 유전자 정량 분석을 성공적으로 수행하였다. 본 연구를 통해 얻어진 단일 세포 유전자 정량분석 기술은 높은 수율과 낮은 단가의 단일 세포 유전자 정량분석을 가능케 할 것으로 기대 된다. 또한 유전자 염기서열 분석기술과 결합되어 단일 세포 전사체 염기서열 분석 등의 기술로 발전될 수 있을 것이다.

In this dissertation, a development of a low-cost and high-throughput single-cell gene expression analysis method is presented. Although the cells are fundamental building block of all living organisms, most of the studies on cell biology have only been achieved on the basis of the collective behavior of large cell populations mainly due to the challenges and limitations in analytical technologies. For this reason, some researches have longed for an improved technology enabling a reliable single-cell-level analysis and they include a study on the heterogeneity of cellular characteristics and an in-depth study on rare cells such as circulating tumor cells and cancer stem cells. Single cell analysis has therefore attracted a great attention and a development of a single cell analysis method addressing important issues in the field of biological and medical sciences is required. Gene expression profiling, which measures level of cellular gene expressions, provides a picture of functional states of cells of interest, reflecting both intracellular and extracellular environments. By virtue of the capability of reporting temporal and spatial status of cellular functions, gene expression profiling is considered to be a powerful method for understanding complicated cellular behaviors depending on intrinsic cellular characteristics as well as extrinsic environmental factors. Gene expression levels may differ among individual cells in a given cell population, and therefore, gene expression analysis with a single cell resolution becomes an important concern in its applications. Here, a new methodology enabling quantification of single-cell gene expression is proposed and developed. In chapter 1, overall guidelines for dissertation are explained. Chapter 2 introduces a background and a motivation of the proposed approach utilizing a number of volume-adjusted microwells for high-throughput single-cell RT-qPCR (Reverse-Transcription quantitative Polymerase Chain Reaction). In chapter 3 and 4, two major technical challenges for achieving a microwell-based single-cell RT-qPCR system are discussed respectively. Chapter 3 demonstrates a development of the microwell-based on-chip PCR platform enabling small volume PCR. The development of small-volume on-chip PCR system includes preparation of microwell arrays, implementation of a real-time PCR equipment, and their application for the realization of small volume PCR. Chapter 4 describes the determination of single-step lysis-RT-PCR condition realized within a fixed reaction volume. The obtained RT-PCR reagent condition enables direct cell-lysis followed by RT-PCR reaction within a single microwell with fixed reaction volume. A detailed discussion on the multivolume microwell array approach is dealt with in Chapter 5. Single cell trapping and subsequent confinement assisted by volume-adjusted microwell arrays are demonstrated. The integration of real-time small-volume on-chip PCR system and one-pot lysis-RT-PCR conditions is also demonstrated. Quantification of single-cell gene expression is finally performed using the integrated single-cell RT-qPCR system. The multivolume microwell array approach is expected to serve as a quantitative analysis system for single-cell gene expression analysis with low cost and high throughput. In addition to realizing the utilization of single-cell RT-qPCR in personalized medicine applications, the microwell-based single-cell analysis system is also expected to be further improved toward single-cell whole transcriptome analysis platform in combination with the use of DNA microarray technology and DNA sequencing technologies.