나노입자 기반의 단백질 검출을 위한 나노슬릿 미세유체칩의 개발

Abstract

본 논문에서는 Lab-on-a-chip에서 사용되는 나노입자를 포획하기 위한 나노구조물이 집적화된 나노슬릿 칩을 개발하였다. 이를 이용하여서 마이크로비드 어세이에 의해 마이크로비드의 표면에 결합된 형광나노입자를 분리하여 나노슬릿 칩에서 포획 및 농축하는 나노슬릿 칩 기반 검출시스템을 개발함으로써, 기존의 마이크로비드 어세이보다 고민감도의 검출이 가능하도록 하였다. 이를 위해 MEMS공정을 이용한 나노슬릿 제작 방법을 개발하였고, 형광나노입자를 분리 및 포획하는 실험을 통해서 제작된 나노슬릿 칩의 성능을 평가하였다. 또한 제작된 나노슬릿 칩에서 나노입자의 크기에 따른 분리 및 포획 기능을 이용하여서 목표 단백질의 농도에 따라 나노입자 복합체가 생성되는 응집반응을 검출할 수 있는 플랫폼으로도 사용하였다. 최종적으로는 마이크로비드 어세이를 위한 미세유체 칩과 나노슬릿 칩을 연계하는 시스템을 구현하였다. 개발한 시스템의 검증을 위해 펩타이드-스트렙타비딘 어세이를 통해 스트렙타비딘이 코팅된 형광 나노입자를 검출하는 실험을 진행하였다. 실험 결과, 마이크로비드 어세이에서는 형광신호가 매우 약하게 나오는 저농도의 샘플의 경우에도, 나노슬릿 칩 기반의 검출에서 검출하며는 나노입자의 농축으로 인해서 형광신호가 증폭되어 민감하게 검출되는 효과를 확인할 수 있었다. 이로 인해 마이크로비드 어세이에서는 잘 보이지 않는 106/ml의 저농도 형광나노입자 샘플인 경우에도 나노슬릿 칩 기반 검출에서는 정량적인 형광신호가 나오는 것을 확인하였다. 이러한 실험결과를 통해 본 연구에서 제안하는 나노슬릿 칩을 이용한 나노입자의 포획 및 농축이 기존의 마이크로비드 어세이의 검출의 한계를 50배 이상 향상시킬 수 있음을 보였다. 본 연구에서 제안하는 나노슬릿 칩은 나노슬릿 박막과 실리콘 하부 유체채널, 그리고 PDMS 상부 유체채널로 구성되어 있다. 나노입자를 포함한 시료들은 PDMS 상부 유체채널을 통해 주입되고, 나노슬릿 박막을 통과하면서 포획되도록 하였다. 또한 본 연구에 사용될 나노슬릿 칩은 액체시료 속에 존재하는 저농도의 나노입자를 포획할 수 있어야 하므로 많은 양의 유체를 흘릴 수 있는 높은 체적흐름을 가지는 소자의 설계가 필요하다. 이를 위해서 나노유체소자의 유체저항을 고려한 설계를 진행하였다. 나노슬릿의 개수가 소자 전체의 체적흐름에 미치는 영양을 수치적인 해석과 FEM시뮬레이션을 통해서 분석하였고, 이러한 분석을 토대로 약 3800개 이상의 나노슬릿을 가지는 유체소자를 설계하여 제작을 진행하였다. 나노슬릿의 제작방법은 일반적인 MEMS공정 방법인 사진공정, 건식식각, 습식식각 등의 공정을 통해서 먼저 마이크로 크기의 슬릿을 만들고, 산화막을 증착하는 방식으로 크기를 줄이는 공정을 시도하였다. 이를 통해 최소 300 nm 크기의 나노슬릇을 제작할 수 있었다. 또한, 300 nm 이하의 선폭을 가지는 나노슬릿을 제작하기 위하여 기존의 사진식각 공정보다 더 작은 선폭이 구현가능한 스텝퍼 (stepper) 공정을 이용한 나노슬릿 제작 공정도 진행하였다. 스텝퍼 장비를 이용한 나노슬릿 제작은 실리콘 질화막에 나노슬릿을 500 ~ 600 nm 선폭으로 만든 후, Cr/Au를 나노슬릿에 증착하여 선폭을 줄이는 방식으로 공정을 진행하였고, 최소 250 nm의 나노슬릿을 만들 수 있음을 확인하였다. 이렇게 제작된 나노슬릿 칩의 나노입자 포획 성능을 평가하기 위하여 유체실험을 진행하였다. 먼저 나노슬릿 칩의 유체저항이 설계된 값에 잘 부합하는지 확인하기 위한 체적흐름측정 실험을 진행하였다. 제작된 나노슬릿 칩은 50 kPa의 인가 압력에 약 250 µl/min의 체적흐름을 나타내었으며 이는 Lab-on-a-chip에서 사용되기에 충분히 빠른 체적흐름이다. 다음으로 800 nm 선폭의 나노슬릿 칩에서 450 nm의 청색 형광입자와 1.8 µm의 적색 형광입자를 크기에 따라 분리하여 포획하는 실험을 진행하였다. 다양한 농도의 미세입자 용액 샘플을 준비한 후, 나노슬릿 칩에 주입하고 형광측정을 통해 형광나노입자들이 나노슬릿에 포획되었는지를 확인하였다. 실험 결과, 105/ml 이하의 농도에서 마이크로입자와 나노입자가 크기 별로 잘 분리되는 것을 확인하였다. 마지막으로 나노슬릿 칩의 크기에 따른 나노입자의 분리 포획 기능을 이용하여 단백질 응집반응을 검출하는 플랫폼으로 나노슬릿 칩을 사용하였다. 실험 결과, 목표단백질인 biotinylated bovine serum albumin (b-BSA)의 농도에 따라 나노슬릿 칩에 걸리는 형광나노입자 복합체들이 증가하는 것을 확인 할 수 있었고, 이때의 목표단백질 검출한계는 10 pM이었다. 본 연구의 최종목표는 마이크로비드 어세이 칩과 나노슬릿 칩을 연계하여 나노슬릿 칩 기반 검출시스템을 구현하는 것이다. 이를 위해 PDMS와 슬라이드 유리를 이용하여 30 µm 크기의 마이크로비드를 포획할 수 있는 어세이 칩을 개발하고, 이를 나노슬릿 칩에 연계하여 미세유체시스템을 구현하였다. 이렇게 개발된 미세유체시스템의 성능을 평가하기 위해서 펩타이드-스트렙타비딘 반응을 이용한 모델링 실험을 진행하였다. 실험에는 스트렙타비딘과 친화적으로 결합할 수 있는 펩타이드 서열 LHPQF이 합성된 30 µm 크기의 마이크로비드와 스트렙타비딘이 코팅된 450 nm의 형광나노입자를 이용하였다. 조건 실험들을 통해 형광나노입자가 펩타이드-스트렙타비딘 반응을 통해 마이크로비드에 결합하고 다시 화학적, 물리적인 방법을 통해 분리될 수 있도록 실험조건을 확립하였으며, 각 단계마다 마이크로비드의 형광을 측정하여 형광나노입자의 결합 및 분리 정도를 확인하였다. 마지막으로 저농도의 형광나노입자를 나노슬릿 칩 기반 검출시스템에서 검출하는 실험을 진행하였다. 실험결과 마이크로비드 어세이 칩에서의 형광신호에 비해서 나노슬릿 칩 기반 검출의 경우, 형광신호가 훨씬 증폭되는 것을 확인할 수 있었고, 이는 형광나노입자의 검출한계를 106/ml로 50배 이상 향상시키는 결과이다. 마지막으로 나노슬릿 칩 기반 검출 시스템의 실제적인 응용으로, 스트렙타비딘 단백질에 대한 펩타이드 서열 후보군의 친화력 검사에 실험을 수행하였다. 3종류의 펩타이드 서열 LHPQF, FHPQG, IHPQG에 대한 스트렙타비딘 단백질의 친화도를 나노슬릿 칩 기반 검출시스템을 통해서 매우 정확하게 정량화할 수 있었다. 본 논문에서 개발된 나노슬릿 칩 기반 검출시스템은 다양한 단백질 검출 방법에 효과적으로 적용될 수 있다. 특히 마이크로비드 기반의 단백질 검출에 있어서 비드의 표면에 분포되어 있는 나노입자를 분리하여 나노슬릿 칩에 농축하는 것은 저농도의 단백질을 검출하는데 기여할 수 있을 것이다. 또한, 나노슬릿 칩은 나노입자가 사용되는 여러 분야에서 나노입자의 양을 정량적으로 검출하는 소자로서 폭넓게 사용될 것으로 기대된다.