Browse

Molecular Analysis of the Bacteria-Bacteriophage Interactions to Improve Phage Biocontrol
파지 응용 생물방제의 향상을 위한 세균-박테리오파지 상호작용의 분자 수준 분석

DC Field Value Language
dc.contributor.advisor유상렬-
dc.contributor.author김민식-
dc.date.accessioned2017-07-13T08:19:21Z-
dc.date.available2017-07-13T08:19:21Z-
dc.date.issued2013-08-
dc.identifier.other000000013573-
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/10371/119444-
dc.description학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 농생명공학부, 2013. 8. 유상렬.-
dc.description.abstract박테리오파지 (파지)는 숙주 세균을 특이적으로 감염하여 죽이는 세균 바이러스이다. 최근 항생제 내성균들의 만연으로 인하여 박테리오파지를 대안적인 생물방제제 (biocontrol agent)로 사용하고자 하는 가능성이 재고되고 있다. 이에 다양한 닭의 분변 및 내장기관 샘플들로부터 살모넬라 또는 대장균 종에 특이적인 9종류의 파지를 분리하였다. 이들 중, SPC35라 명명한 독성 파지 (virulent phage)는 살모넬라 티피뮤리움과 대장균을 모두 감염시킬 수 있는 독특한 특성을 보여 심층적인 연구를 수행하였다. 투과전자현미경을 이용한 형태학적 분석과 118,351-bp로 이루이진 유전체 분석 결과 SPC35는 시포비리대 과 (family Siphoviridae)에 속하는 T5-유사 파지로 밝혀졌으며, 비타민 B12 수용 외막 단백질인 BtuB가 SPC35의 숙주 수용체 (host receptor)로 밝혀졌다. 흥미롭게도, SPC35를 대장균과 살모넬라 티피뮤리움 배양액에 감염시켰을 때 예상보다 빠르게 파지 저항성 돌연변이체 (phage resistant mutant)가 나타났다. btuB 유전자를 살펴본 결과, 대부분의 파지 저항성 대장균 돌연변이체들은 삽입서열 2 (insertion sequence 2-
dc.description.abstractIS2)에 의해 btuB 유전자가 망가져있었다. 이와는 대조적으로 파지 저항성 살모넬라 티피뮤리움 돌연변이체들은 btuB 돌연변이를 가지고 있지 않았으며 SPC35가 없을 때 쉽게 SPC35-감수성 (SPC35-susceptibility)을 회복하여, 이들은 상 변이적인 (phase variable) 파지 저항성을 가지고 있음을 추측케하였다.
비록 BtuB의 파손과 같이 숙주 수용체를 변화시켜 파지의 흡착을 완전히 막는 방법이 파지의 감염에 저항하는 가장 일반적인 방어기작이기는 하지만, 이는 해당 세균에게 잠재적인 적합 대가(fitness cost)를 치르게 한다. 이러한 점에서, 본 연구에서는 살모넬라 티피뮤리움이 O-항원의 상 변이적인 개조를 통해 적합 대가가 없는 일시적인 SPC35-저항성을 나타낼 수 있음을 밝혔다. 일반적으로 파지 SPC35는 숙주 수용체로써 BtuB를 필요로하지만 살모넬라 티피뮤리움을 성공적으로 감염시키기 위해 살모넬라의 O12-항원 또한 흡착-도움 기구 (adsorption-assisting apparatus)로써 사용함을 알아내었다. 살모넬라는 LT2gtrABC1이라 명명한 O-항원 글루코실화 유전자를 상 변이적으로 발현하여, O12-항원의 갈락토오스 잔기를 α-1,4 결합으로 글루코실화시킴으로써 O12-항원의 흡착 도움 작용을 막으며, 이로써 btuB 유전자의 어떠한 돌연변이도 없이 일시적으로 SPC35-저항성을 나타내게 된다. 항원 변이 (antigenic variation)는 병원균의 병원성에 있어서도 이점이 되므로, 위와 같은 상 변이적 항원 개조를 통한 일시적인 파지 흡착의 중단은 아마도 다양한 그람 음성 병원균-파지 관계에 널리 퍼져있을 것이라 생각한다. 이러한 결과들은 성공적인 생물방제를 위해 단일 파지보다 병원균의 서로 다른 수용체를 인지하는 다양한 파지들로 구성된 혼합물 (cocktail)이 더욱 효과적으로 작용할 것임을 말해준다.
온건성 파지 (temperate phage)에 의한 용원성 감염 (lysogenic infection)은 숙주의 SOS-반응에 감응하여 용균성 (lytic) 양식으로 바뀌게 된다. 이러한 변화를 관장하는 궁극적 요소는 파지의 억제자 (repressor)로, 이는 대부분의 온건성 파지들에서 숙주 RecA 단백질에 의존적인 자동-벽개성 (autocleavable) 단백질로 알려져 있다. 살모넬라에 특이적인 포도비리대 과 (Podoviridae family)의 온건성 파지 SPC32H와 SPC32N은 용균반(plaque)의 형태가 서로 매우 다른 표현형적 차이가 있었지만, 이들의 전체 유전체에서는 오직 두 군데에서만 단일 뉴클레오티드 다형성 (single nucleotide polymorphism
-
dc.description.abstractSNP)이 존재했다. 이 단일 뉴클레오티드 다형성이 표현형적 차이를 초래하는 이유를 연구하는 과정에서, 파지 용균성 생활환 전환 기작에 관여하는 새로운 클래스의 항-억제자 (anti-repressor)를 발견하였다. SPC32H의 억제자 (repressor-
dc.description.abstractRep)는 SOS 반응에 의해 잘리지 않았으며, 대신 숙주 LexA 단백질에 의해 그 발현이 음성적으로 조절되는 작은 항-억제자 단백질 (Ant)에 의해 불활성화 되었다. ant 프로모터는 LexA-결합 부위(LexA-binding site) 와 겹쳐져 있었는데, SPC32N의 경우, 이 LexA-결합 부위의 보존적 서열 (consensus sequence)에 단일 뉴클레오티드 돌연변이가 위치하고 있었다. 이에 따라 LexA 결합에 의한 ant 발현의 억제가 불가능하여 Ant가 지속적으로 합성되기 때문에, 파지 SPC32N는 용균성 생활환으로만 편향되어 결과적으로 더 투명한 용균반을 형성함을 알 수 있었다. 아미노산 서열 분석 결과 Ant는 이전에 보고되었던 다른 시포비리대 (Siphoviridae) 및 미오비리대 (Myoviridae) 파지의 항-억제자와 구조적으로 차이가 있었으며, 데이터베이스에서 다수의 Ant 동족체 (homologue)들을 다양한 포도비리대 파지 및 추정 프로파지들 (putative prophages)에서 발견할 수 있었다. 따라서, 보다 신중한 프로파지 유도를 위하여 이러한 항-억제자를 매개로하는 항-억제 시스템이 온건성 파지들 사이에서 널리 퍼져있을 것이라 생각한다. 한편, 본 연구 과정에서 만든 용균성 생활환으로 편향된 돌연변이 온건성 파지들과 여기에 사용된 유전자 조작 기법들은 항생제 대체제 개발 분야에서 다양하게 응용될 수 있을 것이다. 결론적으로, 본 연구에서 분리한 독성 및 온건성 파지들은 살모넬라를 제어하기 위한 새로운 생물방제제로써 실질적으로 사용할 수 있을 것이라 기대된다. 또한, 본 연구를 통해 새롭게 밝힌 세균-파지 상호작용 기작들, 즉 숙주 세균에서 파지 저항성이 나타나는 기작 및 프로파지의 용균성 생활환 전환 기작은 파지를 이용해 병원균을 제어하기 위한 전략을 개발함에 있어서 보다 효과적이고 개선된 방향을 제시하는 데에 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.-
dc.description.abstractBacteriophages (phages) are bacterial viruses that specifically infect and kill the host bacteria. Recently, the widespread emergence of antibiotic-resistant bacteria has led the reconsideration of phages potential as an alternative biocontrol agent. I isolated nine phages specific for Salmonella ssp. or Escherichia coli from various chicken fecal and intestinal organ samples to investigate their potentials as alternative agents to antibiotics. Among them, a virulent phage SPC35, which infect both S. Typhimurium and E. coli, was further studied. Morphological analysis by transmission electron microscopy and analysis of its 118,351-bp genome revealed that SPC35 is a T5-like phage belonging to the family Siphoviridae. BtuB, the outer membrane protein for vitamin B12 uptake, was turned out to be a host receptor for SPC35. Interestingly, resistant mutants of both E. coli and S. Typhimurium were developed faster than my expectation when the cultures were infected with SPC35. Investigation of the btuB gene revealed that an insertion sequence 2 (IS2) element disrupted the btuB of the most of resistant E. coli mutants. In contrast, the resistant S. Typhimurium mutants contain no btuB mutations, and they regained SPC35-susceptibility easily in the absence of SPC35, suggesting a phase variable phage resistance.
Although the alteration of host receptors, such as the disruption of BtuB, is one of the most common bacterial defense mechanism against phage infection by completely blocking phage attachment, it comes at a potential fitness cost to the bacteria. In this respect, I elucidated that S. Typhimurium can develop the cost-free, transient SPC35-resistance through a phase variable modification of the O-antigen. Phage SPC35 typically requires BtuB as a host receptor but also uses the Salmonella O12-antigen as an adsorption-assisting apparatus for the successful infection of S. Typhimurium. The α-1,4-glucosylation of galactose residues in the O12-antigen by phase variably expressed O-antigen glucosylating genes, designated the LT2gtrABC1 cluster, blocks the adsorption-assisting function of the O12-antigen. Consequently, it confers transient SPC35-resistance to Salmonella without any mutations in the btuB gene. This temporal switch-off of phage adsorption through phase variable antigenic modification might be widespread among several Gram-negative pathogen-phage systems, because the antigenic variations also known to confer advantages in pathogenic virulence. These results suggest that a cocktail of phages which target different receptors of the pathogen would be more effective than a sole phage for successful biocontrol.
Lysogenic infections developed by temperate phages are switched to lytic mode in response to the host SOS response. The ultimate factor that governs this switch is a phage repressor, which has been generally identified as a host RecA-dependent autocleavable protein. In an effort to reveal the mechanism underlying the phenotypic differences between the podoviral Salmonella temperate phages SPC32H and SPC32N, which has a single nucleotide polymorphism (SNP) in only two locations in the whole genome, I identified a new class of anti-repressor of the phage lytic switch. The SPC32H repressor (Rep) was not cleaved by the SOS response but, instead, was inactivated by a small anti-repressor protein (Ant), the expression of which is negatively controlled by host LexA. A single-nucleotide mutation in the consensus sequence of LexA-binding site that overlap with the ant promoter results in constitutive Ant synthesis and consequently, inclines SPC32N to enter the lytic cycle. The amino acid sequence analysis indicated that Ant might structurally distinct from the previously reported Sipho- and Myoviridae phage anti-repressors, and numerous Ant homologues were observed in a variety of putative prophages and temperate Podoviridae phages in the database, demonstrating that the induction mediated by anti-repressor may be widespread among temperate phages in the order Caudovirales for prudent prophage induction. The engineering methods used in this study as well as the engineered mutant temperate phages that biased to the lytic cycle could be applied to the fields of alternative antibiotics. In conclusion, the virulent phages as well as the temperate phages isolated in this study can be practically used as the novel biocontrol agents for Salmonella control. In addition, the elucidated mechanisms of bacteria-phage interactions, including the phage-resistance mechanisms in host bacteria and the lytic switch mechanism of prophage, would be the basis for the development of advanced strategies using bacteriophages to combat with the life-threatening pathogens.
-
dc.description.tableofcontentsAbstract I
Contents V
List of Figures IX
List of Tables XIII

Chapter I. Introduction 1
I-1. Bacteriophage 2
I-2. Phage therapy and phage biocontrol 7
A historical perspective 7
Practical phage applications 9
Problems to overcome 13
I-3. Salmonella, a problematic foodborne pathogen 17
I-4. Purpose of this study 20

Chapter II. Characterization of a T5-Like Coliphage SPC35 and Differential Development of Resistance to SPC35 in Salmonella enterica serovar Typhimurium and Escherichia coli 23
II-1. Introduction 24
II-2. Materials and Methods 27
Bacterial strains and growth conditions 27
Plasmid construction 27
Bacteriophage isolation 31
Spotting assay and overlay assay 32
Propagation of SPC35 32
Morphological analysis by TEM 33
Sequencing of SPC35 genomic DNA and genome analysis 34
Phage adsorption assay 34
Bacterial challenge assay 35
Isolation and sub-culturing of SPC35-resistant mutants 35
Amplification and DNA sequencing of btuB 36
II-3. Results 38
Isolation of SPC35 and host range determination 38
SPC35 morphology 38
Sequencing and organization of the SPC35 genome 40
BtuB act as a receptor for SPC35 54
Differential responses of S. Typhimurium and E. coli to SPC35 infection 56
SPC35 resistance is heritable in E. coli mutants but not in S. Typhimurium mutants 58
Disruption of the btuB gene by insertion sequence 2 results in heritable resistance to SPC35 in E. coli 60
II-4. Discussion 65

Chapter III. Spontaneous and Transient Defense against Bacteriophage by Phase-Variable Glucosylation of O-Antigen in Salmonella enterica serovar Typhimurium 70
III-1. Introduction 71
III-2. Materials and Methods 75
Bacterial strains, bacteriophages, plasmids and growth conditions 75
Construction of Salmonella strains 81
Plasmid construction 87
Phage spotting assay 87
Bacterial challenge assay 88
Isolation of SPC35-resistant S. Typhimurium mutants 88
Phage adsorption assay 89
Phage adsorption to LPS 90
LPS extraction and analysis 90
β-Galactosidase assay 92
III-3. Results 94
Transient SPC35-resistance associated with S. Typhimurium O-antigens 94
Salmonella O-antigens play an assisting role in phage adsorption 98
α-1,4-glucosylation of O-antigens confers SPC35-resistance to S. Typhimurium by preventing phage adsorption 105
Phase variable α-1,4-glucosylation of O-antigens is responsible for transient SPC35-resistance in S. Typhimurium 111
III-4. Discussion 117

Chapter IV. Conversion of Temperate Phage to Virulent by Constitutive Expression of Novel Anti-Repressor 127
IV-1. Introduction 128
IV-2. Materials and Methods 132
Bacterial strains and growth conditions 132
Bacteriophages 138
Bacteriophage genome sequencing and analysis 138
Construction of Salmonella mutant strains 139
Construction of phage mutants 150
Plasmids construction 154
Bioluminescence reporter assay 158
Western blot analysis 159
Bacterial two-hybrid assay 160
Purification of proteins, rTEV protease treatment and analytical size-exclusion chromatography 161
Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 162
IV-3. Results 164
Phenotypic differences between SPC32H and SPC32N 164
Two SNPs between SPC32H and SPC32N genome 169
m1 in tsp gene is not responsible for the phenotypic differences 171
Repressor complements the lysogenic development of lytic cycle-biased SPC32N 176
Novel anti-repressor encoded by SPC32H_020 governs the lytic switch 181
m2 in the SOS box causes constitutive expression of anti-repressor from SPC32N 189
The anti-repressor Ant interacts directly with the repressor Rep 197
Introduction of m2 to SPC32H generates the lytic cycle-biased clear plaque mutants 203
IV-4. Discussion 206

References 215
국문 초록 240
-
dc.formatapplication/pdf-
dc.format.extent8312871 bytes-
dc.format.mediumapplication/pdf-
dc.language.isoen-
dc.publisher서울대학교 대학원-
dc.subjectbacteriophage-
dc.subjectphage biocontrol-
dc.subjectSalmonella spp.-
dc.subjectbacteria-phage interaction-
dc.subjectphage-resistance-
dc.subjectanti-repressor-
dc.subject.ddc630-
dc.titleMolecular Analysis of the Bacteria-Bacteriophage Interactions to Improve Phage Biocontrol-
dc.title.alternative파지 응용 생물방제의 향상을 위한 세균-박테리오파지 상호작용의 분자 수준 분석-
dc.typeThesis-
dc.contributor.AlternativeAuthorMinsik Kim-
dc.description.degreeDoctor-
dc.citation.pages1, 243-
dc.contributor.affiliation농업생명과학대학 농생명공학부-
dc.date.awarded2013-08-
Appears in Collections:
College of Agriculture and Life Sciences (농업생명과학대학)Dept. of Agricultural Biotechnology (농생명공학부)Theses (Ph.D. / Sc.D._농생명공학부)
Files in This Item:
  • mendeley

Items in S-Space are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.

Browse