Structural basis for a cofactor-dependent oxidation protection and catalysis of cyanobacterial SSADH

Abstract

해양미생물인 Synechococcus로부터 유래한 Succinic semialdehyde dehydrogenase (SySSADH)는 aldehyde dehydrogenase family에 속하는 효소로서 이 family에 속하는 효소들의 구조와 기능은 이미 잘 알려져 있으며 이 계열 효소들의 주된 기능은 기질의 aldehyde group을 carboxyl group으로 전환하는 것이다. 이들 상호간의 아미노산 1차 서열의 유사성은 적지만 전체적인 구조가 비슷하며 특히 Cysteine과 Glutamate로 이루어진 catalytic loop은 상당히 유사한 특징이 있다. 이런 SSADH 효소들은 γ-aminobutyrate shunt에서 γ-aminobutyrate의 분해 중간 산물인 succinic semialdehyde의 aldehyde group을 산화시켜 succinate를 생성하는 역할을 한다. 하지만 γ-aminobutyrate shunt에서 역할을 하는 다른 유래의 SSADH와는 달리 SySSADH는 2-oxoglutarate dehydrogenase 효소가 결핍되어 있다고 알려진 cyanobacteria의 TCA cycle에서 이 결핍을 우회하는 효소로서의 역할을 한다. SySSADH 효소는 NADP+를 조효소로 사용하여 succinate를 생산하며 활성 부위에 2개의 Cysteine residue를 가진 다른 SSADH와는 달리 1개의 Cysteine을 가지고 있다. 이 논문에서 SySSADH의 구조, 조효소인 NADP+, NADPH 그리고 기질인 Succinic semialdehyde가 결합된 총 3개의 구조를 규명하였으며 이 구조들을 통하여 조효소가 활성부위에 존재하는 Cysteine 잔기에 직접적으로 결합한다는 사실을 밝혔고 이러한 결합이 기질과 조효소의 반응으로 넘어가는 과정에서 thiohemiacetal 중간체로 연결되는 작용 기작을 입증하였다. 추가적인 분석으로 SySSADH는 산화에 민감한 효소로서 조효소인 NADP와 Cysteine의 결합이 과산화 수소의 산화 스트레스에서부터 효소의 활성을 보호하는 역할을 함을 확인하였다. 이러한 SySSADH의 구조적 기능적 특징은 2개의 Cysteine 잔기가 disulfide bridge의 redox를 통하여 산화를 방지하는 방식과는 달리 조효소를 통한 산화 방지 기작을 입증하였다.

Succinic semialdehyde dehydrogenase (SSADH) from cyanobacterium Synechococcus belongs to aldehyde dehydrogenase (ALDH) superfamily. The structure features and functional details for members of ALDH family were well established. The main functional role of the ALDH family is to convert an aldehyde group of substrate to a carboxyl group. In spite of low sequence identity among the members, enzymes in the family exhibit structural similarites and highly conserved catalytic loops including the catalytic cysteine and glutamate residues. SSADHs as a member of the γ-aminobutyrate shunt produce succinate through the oxidation of an aldehyde group in succinic semialdehyde which serves as an intermediate of γ-aminobutyrate degradation. But Synechococcus SSADH (SySSADH) differs from other SSADHs in the γ-aminobutyrate shunt. SySSADH is a TCA cycle enzyme and completes a 2-oxoglutarate dehydrogenase-deficient cyanobacterial TCA cycle through a detour metabolic pathway. SySSADH produces succinate in an NADP+-dependent manner with a single cysteine acting as the catalytic residue in the catalytic loop. Crystal structures of SySSADH were determined in its apo form, as a binary complex with NADP+, and as a ternary complex with succinic semialdehyde and NADPH, providing details about the catalytic mechanism by revealing a covalent adduct of a cofactor with the catalytic cysteine in the binary complex and a proposed thiohemiacetal intermediate in the ternary complex. Further analyses showed that SySSADH is an oxidation-sensitive enzyme and that the formation of the NADP–cysteine adduct is a kinetically preferred event that protects the catalytic cysteine from H2O2-dependent oxidative stress. These structural and functional features of SySSADH provide a molecular basis for cofactor-dependent oxidation protection in 1-Cys SSADH, which is unique relative to other 2-Cys SSADHs employing a redox-dependent formation of a disulfide bridge.