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Improvement of glucose and fructose uptake and furan aldehydes tolerance in Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae 의 포도당과 과당 수송 및 퓨란 알데히드 저항성 증대 연구

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Authors
Daehee Kim
Advisor
한지숙
Major
공과대학 화학생물공학부
Issue Date
2016-08
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
Metabolic engineeringlignocellulosetolerance to furan aldehydeglucose uptakefructose uptakelactic acid productionSaccharomyces cerevisiae
Description
학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 화학생물공학부, 2016. 8. 한지숙.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae는 차세대 연료 생산을 위한 미생물로, 대장균과 함께 미생물을 이용한 연구에 있어서 대표적인 모델로 이용되어 왔다. 본 연구에서는 대사공학적 전략을 이용하여 포도당, 과당 및 목질계 바이오매스 전처리 물질에서 에탄올 및 젖산을 효율적으로 생산할 수 있는 연구를 진행하였다.
첫 번째로, 효모 균주의 에탄올 및 젖산 생산을 증가시키기 위해서 포도당 흡수가 증진된 균주를 제작했다. 효모에서 포도당은 포도당 수송체 (HXT)를 통한 확산을 통해 흡수되며, 이러한 HXT의 발현은 외부 포도당 농도를 인지한 포도당 센서 단백질에서 전달된 신호에 의해 조절된다. 이러한 포도당 수송체의 직접적인 과발현을 통해 포도당 흡수가 증진됨을 관찰했다. 테스트한 5개의 HXT (Hxt1, Hxt2, Hxt3, Hxt4, and Hxt7) 중 포도당에 가장 높은 친화도를 갖는 Hxt7의 과발현이 가장 효과적인 것으로 관찰되었고, 보통의 친화도를 갖는 Hxt2와 Hxt4의 과발현이 또한 효과를 보였다. HXT 발현의 억제 인자로 알려진 mth1과 std1의 결손은 배지 조건에 따라서 포도당 흡수 정도에 다른 영향을 미쳤다. 또, HXT1과 리보솜의 전사를 증가시키는 전사 조절 인자인 Gcr1의 과발현은 증가된 세포 성장과 포도당 흡수 증진을 유도했다. 이러한 포도당 흡수 속도를 강화하는 모든 전략은 에탄올 생산 증가로 이어졌으며, GCR1의 경우 젖산 생산을 위해 변이된 균주에 적용했을 때도 산성 발효 조건에서 포도당 흡수 속도 및 젖산의 생산성과 생산량에 있어서 상당한 증가를 보였다.
두 번째로, 포도당과 과당이 함께 섞인 배지에서 과당 흡수를 증진시키기 위해서 당 인산화 효소와 이형의 과당 수송체를 과발현한 효모 균주를 제작했다. 효모는 포도당이 있는 배지에서 다른 탄소원을 대사 및 흡수하는 과정이 억제되는 단점이 있다. 이는 효모 내 특이적인 과당 수송체가 없기 때문이며, 이를 보완하기 위해 포도당에 친화적인 균주에 과당에 특이적인 수송체를 도입하여 과당을 탄소원으로 이용하는 배지에서 흡수가 증진되는 것을 확인했으며, 과당과 포도당이 섞인 배지에서는 농도에 따라 다른 결과를 보였다. 또한 세포 내부에서 과당 소모를 촉진하도록 6탄당 인산화 효소를 과발현하여 포도당 및 과당이 섞인 배지에서 둘 모두가 빠르게 소모되는 것을 관찰했다. 포도당이 있는 배지에서 가장 주요하게 작용하는 HXK2의 경우 glucose repression을 일으키고 과발현 시 성장 및 활성 억제를 초래하기 때문에, HXK2에 의해 평소에 억제되는 HXK1, GLK1과 아직 그 기능이 제대로 밝혀지지 않은 인산화 효소인 YLR446w를 타겟으로 하였다. 여기서 기존에 알려진 바가 있는 HXK1이 가장 효과적으로 당 소모를 증진시키는 것을 확인했으며, YLR446w과발현 역시 과당의 소모를 증진시켰으며, 이를 통해 이것이 당 인산화 효소로 작용할 수 있음을 간접적으로 확인할 수 있었다. 앞선 포도당 흡수 증진 실험에서와 동일하게, 여기서도 당 소모의 증진은 에탄올 생산으로 모두 이어짐이 확인되었다.
마지막으로, 목질계 바이오매스 기반 에탄올 생산을 위해 푸르푸랄(furfural)과 5-히드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural, HMF)에 대한 저항성 균주를 제작하였다. HMF와 furfural은 산화적인 스트레스를 유발한다고 알려져 있으나, 효모 내에서 어떤 유전적 응답 기작으로 탈 독성화가 이루어지는지 밝혀지지 않았다. 효모 내에서 산화적인 스트레스에 대한 응답 반응은 두 가지 종류로 나뉘는데, thiol에 대한 높은 반응성을 지닌 물질을 통한 방식이나 과산화수소에 의한 방식으로 나뉘게 된다. 각각의 스트레스에서 알려진 타겟의 전사량 변화를 통해서, HMF와 furfural은 thiol과 반응성이 높은 친 전자성 물질로 작용하며, 직접적으로 산화적인 스트레스에 대한 중추로 작용하는 Yap1을 활성화시킨다. 이는 과산화물과는 독립적인 방식으로 작용하며, 세포 내 글루타치온(GSH)를 고갈시키면서 ROS를 축적시키게 되는데, 특히 furfural은 GSH와 in vivo와 in vitro 모두에서 매우 활발하게 반응한다는 것이 확인되었다. 그리고 이러한 알아낸 독성 기작을 통해서, 항상적으로 활성화되어 있는 YAP1C620F의 돌연변이, 그리고 Yap1의 타겟인 카탈라아제(CTA1과 CTT1)의 과발현을 통해 furfural과 HMF에 대한 저항성이 증진됨을 확인했다. 하지만, 글루타치온 합성이나 재생에 관련된 유전자(GSH1과 GLR1)의 과발현에 의하거나, 세포에 직접적으로 이를 첨가함으로써 세포 내 글루타치온을 높이는 것은 furfural에 대한 저항성만을 증진시켰으며, HMF에 대해서는 효과를 보이지 못하는 것이 확인되었다.
Saccharomyces cerevisiae is a multi-platform strain for the production of useful chemicals and fuels. In this thesis, S. cerevisiae was genetically engineered to improve utilization of various carbon sources including glucose and fructose. Also, yeast strain with enhanced tolerance to lignocellulosic furan aldehydes was developed.
Firstly, glucose uptake rate in S. cerevisiae was improved by overexpression of hexose transporters (HXTs) and a growth-promoting transcription factor Gcr1. Among the five tested HXTs (Hxt1, Hxt2, Hxt3, Hxt4, and Hxt7), overexpression of a high-affinity transporter Hxt7 was the most effective in increasing the glucose uptake rate, followed by moderate-affinity transporters Hxt2 and Hxt4. Deletion of std1 and mth1, encoding corepressors of HXT genes, exerted differential effects on the glucose uptake rate, depending on the culture conditions. In addition, improved cell growths and glucose uptake rates were achieved by overexpression of GCR1, which led to increased transcription levels of HXT1 and ribosomal protein genes. All these genetic modifications that enhanced the glucose uptake rate also resulted in the increased the ethanol production rate, compared to wild-type S. cerevisiae. Furthermore, the growth-promoting effect of GCR1 overexpression was successfully applied to lactic acid production in an engineered lactic acid-producing strain, resulting in a significant improvement of productivity and titers of lactic acid production under acidic fermentation conditions
Secondly, the fructose uptake rate was improved by overexpression of a heterologous high affinity fructose transporter and hexokinases (HXKs). To improve the fructose uptake, a high-affinity fructose transporter from fructophilic yeast was introduced into S. cerevisiae. S. cerevisiae strain CEN.PK2-1C expressing Fsy1 originated from Candida magnoliae showed increased fructose uptake in the medium containing either fructose as a sole carbon source or low concentrations of both fructose and glucose, but not in the medium containing high concentrations of both fructose and glucose. Furthermore, to improve intracellular fructose consumption to increase its diffusive intake, hexokinases were overexpressed. Since overexpression of HXK2 repressed yeast cell growth, other HXK genes, such as HXK1, GLK1, and a putative hexokinase YLR446w were overexpressed. Overexpression of these genes increased the glucose/fructose uptake rate. Especially, the overexpression of HXK1 improved the uptake of glucose and fructose most, followed by the overexpression of the putative hexokinase Ylr446w. Although overexpression of each hexokinase gene was effective in glucose or fructose uptake, overexpression of CmFsy1 decreased the glucose uptake of all strains in the media containing high concentrations of both glucose and fructose.
Lastly, yeast strains tolerant to 5-hydroxymethylfurfural (HMF) and furfural, inhibitors generated during the pretreatment of lignocellulosic biomass, were developed. In this part, HMF and furfural were identified as thiol-reactive electrophiles, thus directly activating the Yap1 transcription factor via the H2O2-independent pathway, depleting cellular glutathione (GSH) levels, and accumulating reactive oxygen species in S. cerevisiae. However, furfural showed higher reactivity than HMF toward GSH in vitro and in vivo. In line with such toxic mechanisms, overexpression of YAP1C620F, a constitutively active mutant of YAP1, and Yap1 target genes encoding catalases (CTA1 and CTT1) increased tolerance to furfural and HMF. However, increasing GSH levels by the overexpression of genes for GSH biosynthesis (GSH1 and GLR1) or by the exogenous addition of GSH to the culture medium enhanced tolerance to furfural but not to HMF.
Language
English
URI
https://hdl.handle.net/10371/119814
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College of Engineering/Engineering Practice School (공과대학/대학원)Dept. of Chemical and Biological Engineering (화학생물공학부)Theses (Ph.D. / Sc.D._화학생물공학부)
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