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Investigation of mixed sugar fermentation for production of ethanol by engineered Saccharomyces cerevisiae
재조합 효모를 이용한 혼합당으로부터 에탄올 생산

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Authors
배이현
Advisor
서진호
Major
공과대학 협동과정 바이오엔지니어링전공
Issue Date
2014-08
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
Sacchaomyce cerevisiaebioethanolmixed sugar fermentationgalactosexylosecatabolite repressioncatabolite inactivationexpression-level optimizationδ-integrationcofactor levels효모바이오에탄올혼합당 발효포도당갈락토스자일로스포도당에 의한 전사억제포도당에 의한 후번역 변형발현양 최적화델타 삽입보효소
Description
학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 협동과정 바이오엔지니어링전공, 2014. 8. 서진호.
Abstract
바이오에탄올의 경제적인 생산을 위해서는 바이오매스 유래의 당을 효율적으로 이용하는 것이 중요하다. 특히, 해양 바이오매스에 많이 존재하는 갈락토스와 목질계 바이오매스의 주요 구성 성분 중 하나인 자일로스를 효율적으로 이용하는 것이 중요하다. 그러나 전통적으로 에탄올 생산에 이용되는 균주인 Saccharomyces cerevisiae (이하 효모로 지칭)는 포도당은 효율적으로 발효하지만, 다른 당들에 대한 대사능은떨어지는 단점이 있다. 효모의 혼합당 발효능을 개선하기 위해서는 발효 공정 중 효모에 어떤 변화가 일어나는지에 대한 이해가 필요하다.
본 논문은 효모를 이용한 혼합당으로부터의 에탄올 생산에 미치는 여러 인자들에 대해 분석하고, 혼합당 발효능이 우수한 균주 구축에 관한 연구 내용을 정리한 것이다. 연구는 다음과 같은 부분에 초점을 두었다.
첫째, 바이오매스 유래의 당 혼합물에는 포도당이 다량 함유되어있다. 포도당은 세포에 광범위한 변화를 유발하는데, 이러한 변화는 직∙간접적으로 포도당이 아닌 다른 당의 대사에도 영향을 줄 수 있다. 둘째, 에탄올 생산에 있어서 높은 수율을 얻기 위해서는 산소를 제한하는 공정 조건이 바람직한데, 이와 같은 조건에서 효모는 호기 조건과는 매우 다른 대사적 특성을 가진다.
먼저 혼합당 발효시 세포 내에서 어떤 대사적인 변화가 일어나는지 살펴보았다. 대사 분포 분석을 통해 포도당 존재하에서 산소 공급이 제한될 경우 세포는 신속하게 발효 모드로 대사 상태를 전환하는 것을 확인하였다. 다음으로 포도당에 의한 전사 억제(catabolite repression) 및 후(後)번역 변형(catabolite inactivation)에 대해서 분석하였고, 포도당이 존재할 경우 다른 당 이용과 관련된 mRNA 및 단백질들이 영향을 받는 것을 확인하였다. 한편 산소가 제한된 조건에서는 단일 탄소원으로 이용할 경우와 혼합당을 이용할 때 전혀 다른 발효 패턴을 보일 수 있음을 확인하였다(Kluyver effect).
갈락토스는 야생형 효모가 대사할 수 있는 육탄당이지만, 포도당이 모두 소모된 후에 갈락토스가 이용되는 특성을 가진다. 호기 조건과 산소 제한 조건에서의 발효 프로파일을 비교해보면, 산소가 제한될 경우 대사 유연성이 크게 감소함을 확인할 수 있었다. 즉, 산소 제한 조건에서는 포도당이 모두 소모가 된 후에도 갈락토스가 전혀 이용되지 않고 남아 있었다. 포도당과 갈락토스 혼합당 발효능을 향상시키기 위해서, 효모 내에서 전사 억제와 조절과 관련된 유전자인 HXK2 유전자를 제거하였다. 정량적 mRNA 분석을 통해 HXK2 유전자 제거 균주에서 갈락토스 대사 유전자의 발현이 크게 증가함을 알 수 있었다. HXK2 유전자 제거 효모는 호기 조건뿐만아니라 산소 제한 조건에서도 포도당 이용 후에 갈락토스를 순차적으로 이용하였다. 이 균주를 이용하여 회분식 발효를 수행한 결과를 분석했을 때, 갈락토스 발효 구간에서도 포도당 발효에서와 동일한 에탄올 수율을 얻을 수 있었다(0.43±0.01 g 에탄올/g 갈락토스, 이론 수율 대비 88%).
자일로스는 자연계에서 두번째로 가장 많이 존재하는 당이지만, 효모는 자일로스 대사능을 가지고 있지 않다. 따라서 효모가 자일로스로부터 에탄올을 생산하기 위해서는 다른 미생물로부터 얻은 자일로스 환원 효소 (XR), 자일리톨 탈수소 효소(XDH) 및 자일룰로스 인산화 효소(XK)를 암호화하는 유전자를 도입해주어야한다. 그러나 포도당과 자일로스 발효에서는 시간이 흐름에 따라 자일로스 대사 성능이 점점 저하되었고, 상당량의 자일로스가 이용되지 않고 배지 중에 남아 있었다. 자일로스 발효능을 향상시키기 위해서, 어떤 요인들이 혼합당 발효능에 영향을 주는지를 분석하였다. 포도당에 의한 전사 억제 기작은 자일로스 발효에 아무런 영향을 주지 않은 반면, 당 이송체 관련 후번역 변형 기작은 혼합당 발효에 영향을 줄 수 있음을 ROD1 유전자 제거 균주를 이용하여 확인하였다. 다음으로, 서로 다른 세기를 가지는 프로모터를 이용하여 XR, XDH, XK를 과발현 한 후 각각의 발효 성능을 비교 분석하였고, 이를 바탕으로 발효능이 향상된 재조합 균주를 구축할 수 있었다. 그러나 유전자 카세트가 염색체에 비삽입된 균주는 형질이 불완전하였기 때문에, 델타 삽입법을 이용하여 안정된 형질을 가지면서 우수한 자일로스 발효능을 가지는 균주(BX1)를 구축하였다. 이 균주는 모균주인 DX123에 비하여 자일로스 소모 속도 및 에탄올 생산성이 각각 1.6배, 1.2배 향상되었으며, 70g/L 포도당과 40g/L 자일로스로 구성된 혼합당 발효에서 42.3±0.9 g/L의 최종 에탄올 농도를 얻어, 같은 조건에서 35.3±0.5 g/L의 에탄올을 생산한 모균주인 DX123보다 향상된 혼합된 발효능을 보였다. 발효기 수준에서도 비슷한 결과를 확인하였다. 한편, 자일로스로부터의 높은 에탄올 수율을 얻기 위해서는 부산물인 자일리톨의 형성을 억제하는 것이 중요한데, 산소 공급이 제한될수록 자일리톨의 형성이 증가하는 발효 패턴을 보였기 때문에 세포 내 보효소 수준에 따라 자일리톨의 형성되는 정도를 시뮬레이션을 통해서 테스트하였다. 시뮬레이션 결과는 NADH/NAD+ 비율 및 ATP 수준과 자일리톨 축적 간에 밀접한 연관이 있음을 암시하였다.
본 연구를 통해 자연계에 포도당 다음으로 풍부하게 존재하는 갈락토스와 자일로스를 다량 함유한 혼합당의 발효를 다양한 측면에서 분석하였고, 혼합당 발효시 세포 내에서 어떤 변화가 일어나는지에 대한 유용한 정보를 얻을 수 있었다. 이 연구에서 사용된 분석 방법 및 균주 개량 방법들은 갈락토스와 자일로스 외의 다른 당들의 발효 성능을 향상 시키는데 적용될 수 있다는 점에서 그 의의를 가진다.
Efficient utilization of biomass-derived sugars is one of the key issues for economic viability of bioethanol. Among various sugars, galactose and xylose are of special interest because they are abundant in marine and lignocellulosic biomass, repectively. But the bakers yeast S. cerevisiae, a traditional ethanol producer, can not efficiently ferment sugars other than glucose. To improve mixed sugar fermentation by S. cerevisiae, it is necessary to understand what happens to the cells during the mixed-sugar fermentation process.
One of the most important concerns in mixed sugar fermentation is the glucose effect, which may affect utilization of non-glucose sugars in direct or indirect ways. Another important factor that should be considered is low aeration conditions during fermentation processes, which is preferred to obtain high ethanol yield. Normally, the yeast displays distinct metabolic properties as compared to aerobic conditions. In this thesis, several efforts were made to understand the physiology of S. cerevisiae in the presence of glucose. The metabolic flux analysis revealed that S. cerevisiae rapidly changes its metabolic status to a fermentative mode. In the circumstances, the cells only could possess restricted energy currencies such as ATP and NADPH. In addition, it was shown that the cells were affected by glucose at the levels of transcription (catabolite repression) and post-translational regulation (catabolite inactivation). Furthermore, galactose was not consumed after glucose depletion in oxygen-limited condition (the Kluyver effect), although S. cerevisiae has a set of galactose metabolizing enzymes.
To improve glucose and galactose fermentation, catabolite repression was alleviated by deleting the gene coding for hexokinase 2 (HXK2). The transcription of the GAL genes was significantly elevated in the ∆hxk2 strain. The Δhxk2 strain could ferment galactose after glucose depletion in both aerobic and anaerobic conditions. It seemed that the Δhxk2 strain could efficiently utilize both glucose and galactose by preparing the GAL gene transcripts during the glucose consumption period, thereby lessening the time required to synthesize the Leloir proteins before suffering shortage of available carbon sources. As a result, 0.43±0.01 g ethanol/g galactose of ethanol yield was obtained, which was equivalent to the ethanol yield from glucose.
Improvement of glucose and xylose fermentation, however, was not simple. For example, when a glucose and xylose mixture was fermented by recombinant S. cerevisiae harboring the genes coding for Pichia stipitis xylose reductase (XR), xylitol dehydrogenase (XDH), and xylulose kinase (XK), called the DX123 strain, the xylose consumption rate decreased over time and eventually ceased, contrary to the glucose and galactose fermentation. In order to find limiting factors in glucose and xylose fermentation, firstly, the glucose effect was examined. It was shown that catabolite repression is irrelevant to the fermentation performance. In contrast, controlling catabolite inactivation of transporters improved glucose and xylose consumption, especially when supported by sufficient XR and XK activities. Next, the expression level of XR, XDH and XK was modulated by varying promoter strength. The HXT7 promoter-regulated XR expression and the TEF1 promoter-controlled XK expression were proven to be effective in terms of xylose consumption rate, xylitol accumulation, and final ethanol concentration. The expression cassette was introduced into the DX123 strain to construct the BX1 strain. In the glucose and xylose fermentation performed with the BX1 strain, xylose consumption and ethanol productivity increased by 1.6-fold and 1.2-fold, respectively, as compared to the DX123 strain. And 42.3±0.9 g/L of final ethanol concentration was obtained, while the DX123 strain only produced 35.3±0.5 g/L of ethanol from a mixture of 70 g/L of glucose and 40 g/L of xylose. Batch fermentation with the BX1 strain resulted in 43.8±0.8 g/L of final ethanol concentration with a yield of 0.40±0.01 g ethanol/g sugar, and productivity of 1.04±0.02 g/L∙h (at 0.1 vvm). But the concentration of xylitol varied according to aeration conditions. The simulation result suggested that NADH/NAD+ ratio and ATP level can affect xylitol accumulation.
The present investigation would provide useful information to understand multifaceted aspects of mixed sugars fermentations. In addition, the metabolic engineering strategies used in this study could be applied to improving fermentations of biomass-derived sugars.

Keywords: Sacchaomyce cerevisiae, bioethanol, mixed sugar fermentation, galactose, xylose, catabolite repression, catabolite inactivation, expression-level optimization, δ-integration, cofactor levels
Language
English
URI
https://hdl.handle.net/10371/119878
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College of Engineering/Engineering Practice School (공과대학/대학원)Program in Bioengineering (협동과정-바이오엔지니어링전공)Theses (Ph.D. / Sc.D._협동과정-바이오엔지니어링전공)
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