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Role of resolvin D1 in experimentally induced inflammation and colon carcinogenesis
Resolvin D1에 의한 염증 해소 및 염증으로 유도된 대장암 억제 기전 연구

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Authors
이하나
Advisor
서영준
Major
약학대학 약학과
Issue Date
2013-08
Publisher
서울대학교 대학원
Keywords
Resolvin D1Resolution of inflammationEfferocytosisNF-κBOxidative stress-induced apoptosisNADPH oxidase 2ALX/FPR2Inflammation-induced tumorigenesisSpindle multipolarityCyclin D1Signal transducer and activator of transcription 3
Description
학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 약학과 의약생명과학 전공, 2013. 8. 서영준.
Abstract
염증이란 생체조직이 외부로부터 자극을 받을 때, 유해인자를 제거하고 손상부위를 정상으로 회복시킴으로써 그 영향을 국소화 하려는 생체 방어기전 중 하나이다. 그러나 염증의 해소가 제대로 이루어지지 못하면, 급성 염증은 만성 염증으로 발전하여 암을 비롯한 인체 대부분의 질환의 원인이 된다. 따라서 만성 염증성 질환 및 암 치료제 개발에 있어 염증의 해소에 대한 이해는 필수적이다. 염증 반응은 개시부터 해소에 이르는 일련의 과정동안 다양한 매개체에 의해 조절한다. 이전까지만 해도 친염증성 매개체(pro-inflammatory mediator)가 분해되어 염증반응이 멈추는 것으로 알려져 있었지만, 최근에는 염증의 해소 과정을 레졸빈과 같은 내인성 pro-resolving 매개체에 의해 조절되는 능동적 과정으로 인식되고 있다. 레졸빈은 염증부위로의 호중구 유입을 막고, 염증부위에 유입된 백혈구의 세포사멸을 유도하고, 사멸된 세포를 대식세포가 제거한 후 림프관을 통해 빠져나가게 하고, 혈관 확장 및 투과를 복원시키며, 친염증성 신호전달을 종결시킴으로써 염증이 유발된 조직을 회복시키는 작용을 한다.
염증반응 후기에 내생적으로 생성되어 염증의 해소를 촉진시킨다고 보고된 레졸빈은 resolution phase interaction products 에서 기인하였으며, EPA에서 기인한 레졸빈은 레졸빈 E (RvE), DHA가 대사되어 합성된 레졸빈은 레졸빈 D (RvD)라 일컫는다. 레졸빈 D 중 하나인 RvD1은 염증 해소에 있어 가장 중요한 단계인 사멸된 백혈구를 제거하는 과정, 즉 efferocytosis 과정을 효과적으로 촉진시킨다고 보고되어 있다. Chronic inflammatory lung disease, chronic granulomatous disease 등 만성염증 관련 질환에서 대식세포의 efferocytosis 능력 손상이 발견되고 있기에, RvD1이 만성염증 관련 질환의 치료제로 기대되고 있지만 아직 그 분자적 기전에 대한 이해는 부족한 편이다. 따라서 본 연구에서는 RvD1이 어떠한 분자적 기전을 통하여 염증해소와 efferocytosis를 촉진시키는지 알아보았다.
우선 zymosan A를 이용하여 마우스에 복막염을 유도시킨 후, 염증이 최대치에 도달한 순간 RvD1을 처리하여 RvD1의 pro-resolving 효과를 살펴보았다. RvD1 처리한 그룹에서는 복강 내 유입된 염증세포의 수가 현저히 감소되었지만, 염증 해소에 있어 중요한 단핵구의 비율은 상대적으로 증가함을 보였다. 또한 RvD1 처리시, efferocytosis를 한 대식세포의 비율이 높아졌다. 이러한 RvD1의 pro-resolving 효과는 TNF-α 생성 저해를 통해 나타났다. RvD1이 TNF-α 발현을 억제하는 데 있어 classical NF-κB pathway의 차단이 중요한 것으로 보여진다. 뿐만 아니라 RvD1은 p65/p50의 경쟁자로 작용하여 classical NF-κB signaling을 저해하는 역할을 하는 p50/p50 homodimer의 형성을 촉진하여 보다 효과적으로 TNF-α 의 생성을 저해하였다. 이상의 결과를 요약하면, 염증 유발물질은 만성염증의 원인 중 하나인 TNF-α의 과다 생성을 유도하여 대식세포의 efferocytosis를 억제함으로써 염증의 resolution을 방해하는 것으로 보여진다. 하지만 생체 내에서 resolution동안 합성되는 RvD1이 classical NF-κB pathway 를 저해할 뿐만 아니라 p50/p50 homodimer의 형성을 촉진하여 TNF-α 의 생성을 효과적으로 억제하고, 이를 통하여 대식세포의 efferocytosis 능력을 회복시켜 염증의 종결을 촉진하는 것으로 사료된다
일반적으로 포식세포는 식세포작용 시 발생되는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 의하여 산화적 스트레스를 받는다. 하지만 대식세포가 efferocytosis 후 세포사멸을 일으켜 염증부위에 남게 되면 동맥경화증과 같은 만성염증을 일으킬 수 있다. 하지만 정상적 생리 환경에서 어떠한 메커니즘으로 대식세포가 efferocytosis에 의한 산화적 스트레스를 극복하고 생존할 수 있는지에 대한 연구는 전무한 상태이다. 본 연구에서는 염증의 resolution을 매개하는 물질 중 하나인 RvD1이 efferocytosis에 의한 산화적 스트레스로부터 대식세포를 보호하는 역할을 할 수 있는지 확인해 보고자 하였다.
RAW264.7 마우스 대식세포를 apoptotic Jurkat T 세포와 공배양하여 efferocytosis를 유도한 결과, RAW264.7 세포의 세포사멸을 관찰할 수 있었다. 이를 통하여 대식세포가 efferocytosis 후 사멸이 되지 않는 원인이 대식세포의 자체적 방어기전에 의함이 아니라는 결론을 도출할 수 있다. Efferocytosis에 의한 세포사멸은 RvD1 처리한 대식세포에서는 현저히 감소되었고, 이는 RvD1이 efferocytosis에 의한 ROS 발생을 저해하여 나타난 결과임을 확인하였다. 대개 포식작용 후 증가되는 활성산소종은 포식세포 내 존재하는 NADPH oxidase (NOX)를 통해 생성이 된다. Efferocytosis에 의하여 증가된 ROS가 NOX2 활성화에 의해 비롯되었는지 확인하고자, NOX2 억제제인 apocynin을 처리한 후 세포사멸과 ROS 생성을 측정하였다. 그 결과, apocynin 처리한 대식세포에서는 efferocytosis에 의해 유도된 세포사멸과 ROS 발생이 저해되었다. 또한 RvD1 처리시, p47phox의 인산화가 억제되어 NOX2 활성화를 억제함으로써 O2-의 발생을 저해하여 산화적 스트레스의 감소를 유도함을 관찰하였다. Protein kinase A (PKA)가 p47phox 인산화 저해를 유도한다는 보고를 바탕으로 RvD1에 의한 NOX2 활성 억제에 있어 PKA의 관여 가능성을 살펴보았다. RvD1 처리 시 시간에 따라 PKA 활성이 증가됨을 관찰하였고, PKA 저해제인 H89를 처리한 세포에서는 RvD1에 의한 p47phox 인산화 감소효과가 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통하여 RvD1에 의한 PKA 활성화가 efferocytosis에 의한 NOX2 활성 억제를 유도하여, 산화적 스트레스의 발생을 저해한다는 사실을 규명하였다.
이러한 RvD1의 염증 해소 촉진 작용은 염증에 의한 암 발생을 억제하는데 기여할 것으로 예상된다. 이를 규명하기 위하여 염증에 의한 암화 과정을 설명할 수 있는 azoxymethane/dextran sulfate sodium (AOM/DSS) 유발 대장암 동물모델을 구축한 후, RvD1을 주입하여 그 효과를 살펴보았다. 그 결과, AOM/DSS에 의하여 증가된 용종의 수 및 이형증성 대장병변이 고농도의 RvD1을 처리한 경우 현저히 감소됨을 확인할 수 있었다. RvD1의 암화 억제기전을 보다 자세히 살펴보기 위해 정상 대장상피세포주인CCD841CoN에 염증에 의한 대장암 유발에 관여한다고 보고된 IL-6를 처리해 보았다. IL-6에 의한 세포의 악성변이 및 다극성 방추사 형성이 RvD1을 함께 처리한 세포에서 현저히 감소됨을 확인하였다. 이 때, IL-6에 의한 세포의 악성변이 및 다극성 방추사 형성이 cyclin D1의 과발현을 통하여 일어남을 확인할 수 있었고, RvD1이 IL-6에 의한 cyclin D1 발현을 저해하여 암화 억제 효과를 나타낸다는 사실을 규명하였다.
본 연구를 통해 제시된 RvD1에 의한 염증 해소 및 염증관련 대장암 예방 효과를 기반으로 RvD1가 다양한 염증성 질환 및 암 예방 치료제로 개발 가능할 것이라 사료된다.
Acute inflammation, a physiologic response to protect cells from microbial infection and other noxious stimuli, can be successfully completed through effective resolution and tissue repair. Resolution of inflammation requires the elimination of key inflammatory cells and the concomitant downregulation of pro-inflammatory mediators in the inflamed sites. This process is actively regulated by coordinated biochemical mediators which possess anti-inflammatory and/or pro-resolving effects. Resolvins (Rvs), one of endogenous lipid mediators generated from omega-3 fatty acids, have emerged as a novel class of potent molecules that counteract excessive inflammatory responses and stimulate pro-resolving mechanisms
regulating the trafficking of leukocytes and stimulating non-phlogistic phagocytosis of apoptotic neutrophils by macrophages. The disruption of these anti-inflammatory and pro-resolving mechanisms can be related not only to the initiation of unnecessary inflammation, but also to the persistence of inflammation which contributes to the pathogenesis and progression of chronic inflammatory diseases as well as cancer. Since inflammation has the beneficial effect on host defense, the complete resolution of inflammation is better to avoid chronic inflammatory situation, rather than merely blocking inflammation at the beginning. In this regards, understanding of the mechanism underlying resolution of inflammation will open new therapeutic approach to prevent and treat chronic inflammatory diseases and cancer.
Phagocytosis of apoptotic neutrophils, termed efferocytosis, is pre-requisite for complete resolution of inflammation as it prevents the exposure of surrounding tissues at the inflamed site to toxic contents of lytic cells. RvD1, endogenously generated from docosahexaenoic acid during resolution of inflammation, is known to stimulate efferocytosis. However, the molecular mechanism underlying RvD1-mediated enhancement of efferocytosis remains largely unresolved. In the present study, murine macrophage-like RAW264.7 cells treated with lipopolysaccharide (LPS) exhibited markedly reduced efferocytic activity, but this was restored by the co-incubation with RvD1. RvD1-induced restoration of the efferocytic activity appears to be mediated by down-regulating the LPS-induced TNF-α expression. The inhibitory effect of RvD1 on LPS-induced TNF-α expression was associated with enhanced nuclear localization of p50/p50 homodimer and concomitant reduction of p65/p50 heterodimer accumulation in the nucleus. RvD1 triggered phosphorylation and proteasomal degradation of nuclear factor κB1 (NF-κB1) p105 to generate p50, which was subsequently translocated to nucleus as p50/p50 homodimer. Knockdown of NF-κB p50 abolished the ability of RvD1 to suppress TNF-α expression and also to restore efferocytosis, suggesting that the replacement of p65/p50 with p50/p50 homodimer in the nucleus is critical for RvD1-mediated stimulation of efferocytosis. These findings indicate that RvD1 expedites the resolution of inflammation through induction of efferocytosis through p50/p50 homodimer-mediated repression of TNF-α production.
Macrophage death during resolution of inflammation causes failure in resolution of inflammation, thereby leading to chronic inflammatory disorders such as atherosclerosis. During efferocytosis, engulfment of apopototic cells induces generation of reactive oxygen species (ROS) in abundance. Even though macrophages which possess apoptotic cells suffer from oxidative stress, they normally overcome oxidative stress-induced apoptosis and leave the inflamed site via lymphatics in physiological conditions. However, the mechanism underlying macrophage survival after efferocytosis has not been elucidated. In the present study, we found that RvD1 has the preventive effect on efferocytosis-induced apoptosis. The inhibitory effect of RvD1 on efferocytosis-induced oxidative burst appears to be mediated through the inactivation of NADPH oxidase (NOX), a key enzyme involved in intracellular ROS production. In RvD1-treated macrophages, efferocytosis-induced phosphorylation of p47phox and association between p47phox and gp91phox were downregulated, resulting in abrogation of generation of superoxide anion and hydrogen peroxide. Furthermore, RvD1-mediated suppression of NOX activation was found to be dependent on cAMP-activated protein kinase (PKA) signaling. Besides inhibiting NOX activation, RvD1 rescued macrophages from oxidative stress-induced apoptosis by upregulating the expression of Bcl-xL and Bcl-2. However, knockdown of the RvD1 receptor, lipoxin A receptor/formyl-peptide receptor (ALX/FPR2), abolished the ability of RvD1 to activate cAMP-PKA signaling, to suppress NOX activation and to increase the expression of anti-apoptotic proteins, suggesting that ALX/FPR2 mediates the protective effect of RvD1 on effeocytosis-induced oxidative stress. Taken together, these data indicate that RvD1 protects macrophages against oxidative stress-induced apoptosis during efferocytosis through PKA-mediated repression of NOX activation and upregulation of anti-apoptotic protein expression, thereby promoting resolution of inflammation.
If timely resolution of inflammation is failed, inflammation persists and can progress to a chronic inflammation which has long been thought as a predisposing factor to carcinogenesis. Excessive and pathologic inflammation is considered to increase the risk of colorectal cancer, possibly by inducing chromosomal instability. However, the precise pathologic mechanisms underlying inflammation-induced chromosomal instability and subsequent tumorigenesis are not well understood. RvD1 is known to suppress excessive inflammatory responses and promote resolution of inflammation, and hence expected to protect against chronic inflammation-induced cancer. Using the azoxymethane (AOM) plus dextran sodium sulfate (DSS) colitis-associated colorectal cancer model, we revealed that RvD1 attenuated inflammation-induced tumorigenesis. Moreover, it reduced AOM/DSS-induced production of pro-inflammatory cytokine interleukin-6 (IL-6), which is considered to play a key role in chronic inflammation and cancer. IL-6 triggered malignant transformation and abnormalities of mitotic spindle and nucleus in intestinal epithelial CCD841CoN cells, and these effects were abolished by RvD1. The inhibitory effect of RvD1 on chromosomal instability was associated with downregulation of IL-6-induced cyclin D1 expression which was mediated by inhibiting Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 signaling. Knockdown of cyclin D1 abolished IL-6-induced mitotic spindle abnormality, but overexpression of cyclin D1 increased the number of cells showing multipolar spindles, leading further support to the notion that cyclin D1 contributes to mitotic spindle abnormality.
Taken together, these observations suggest that endogenous pro-resolving lipid mediator RvD1 facilitates resolution of inflammation by promoting efferocytosis and protecting macrophages from oxidative stress-induced apoptosis, thereby preventing chronic inflammation. Moreover, RvD1 exerts the chemopreventive effect on colitis-associated colon carcinogenesis
Language
English
URI
https://hdl.handle.net/10371/120054
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Appears in Collections:
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