Differential Regulation of Apoptosis and Autophagy by Antitumor Natural Products: Akebia Saponin PA, Jujuboside B and Glycyrol

Abstract

본 연구에서는 천연물로부터 분리된 화합물의 항암기전에서 세포사멸과 자가포식의 작용관계 및 그 기전에 관하여 연구하였다. 자가포식은 불필요한 및 기능을 잃은 세포내용물이 리소좀에 의해 제거함으로써 항상성을 유지하는데 중요한 작용을 하는 세포의 고유작용이다. 이 과정은 세포내의 손상된 세포기관 및 단백질 밀집체를 분해함으로써 세포네 스트레스를 완화시켜 세포사멸 작용을 억제할 수 있지만, 과도하게 일어나면 세포질의 심한 분해에 의하여 세포죽음을 초래하게 된다. 세포성장유지 및 세포죽음 두 가지 상반된 작용을 할 수 있기에 자가포식 작용을 명확히 하고 이것을 이용하는 것은 항암제 효과를 최대화 하는데 중요한 작용을 한다. 천연물은 다양한 신호전달체계를 통하여 항암활성을 나타낸다고 널리 알려져 있고 오랜 시간 동안의 사용은 그의 안전성과 효과를 말해준다. 천속단에서 분리된 사포닌인 akebia saponin PA, 산조인에서 분리된 사포닌인 jujuboside B 및 감초에서 분리되고 전합성한 코메스탄 (coumestan) 계열인 glycyrol은 암세포의 세포사멸과 자가포식의 차별적 작용관계에 의한 세포죽음을 유도한다. MTT assay, annexin V-PI staining, sub-G1 phase의 증가 및 caspase-3의 활성화와 PARP-1의 cleavage를 통하여 물질의 세포사멸 유도작용을 확인하였다. 세포내부 vacuole의 생성, acridine orange 염색 및 LC3-II의 증가를 관찰 함으로써 물질의 자가포식 유도작용을 확인할 수 있었다. 기전연구 통하여 실험한 결과 akebia saponin PA는 자가포식에 의한 세포죽음을 유도하되 이와 동시에 자가포식작용은 MAPKs 인 JNK/p38의 활성화를 통해 FasL를 증가시킴으로써 caspase 활성화에 의존한 세포사멸을 유도한다는 사실을 알 수 있었다. Jujuboside B는 외인성 경로를 통한 세포사멸을 유도하되 이와 동시에 세포보호작용의 자가포식을 유도함으로써 세포사멸을 저해한다는 사실을 알 수 있었다. 따라서 자가포식 억제제와 동시처리는 jujuboside B 항암활성을 더 증가시킬 수 있다는 점을 제시하는 봐 이다. Glycyrol는 DNA 손상, 세포주기 차단을 유도한다. 또한 JNK/p38 MAPKs 인산화를 통하여 caspase 활성화에 의존한 세포사멸을 유도하되 이는 AMPK의 인산화를 촉진함으로써 자가포식을 유도하지만 리소좀 산성조건의 파괴에 의해 자가포식 작용이 억제된다는 것을 알 수 있었다. 따라서 akebia saponin PA, jujuboside B 및 glycyrol이 천연물로부터 분리된 항암 후보물질로서 가치가 있을 것으로 생각되며, 세포죽음유도에 있어서 세포사멸과 자가포식의 차별적 작용관계를 명확히 하는 것은 그의 항암효과를 최대화 하는데 중요한 작용을 한다.

In this study, the antitumor activity of natural products through differential regulation of apoptosis and autophagy, and the underlying mechanism were investigated. Macroautophagy (simply autophagy) is a lysosome-mediated degradation and recycling of intercellular components to maintain cellular homeostasis. Autophagy can serve as a cell survival pathway by removal of scavenge-damaged organelles and protein aggregates to reduce cellular stress that causes apoptosis, whereas excessive autophagy can cause cell death by over-degradation of cytoplasm. Therefore, understanding and modulating the complexity of the role of autophagy is crucial to maximizing the full potential of cancer therapies. Natural products are known to have anticancer effect through multiple cellular signaling pathways because of the complexity in signal transduction, and are under consideration as cancer chemoprevention agents due to their long standing efficacy and safety in many traditional usages. Akebia saponin PA (AS) is a natural product isolated from Dipsacus asperoides, jujuboside B (JB) is a saponin component isolated from the seed of Zizyphus jujuba var. spinosa, and glycyrol is a coumestan compound isolated from Glycyrrhiza uralensis and has been synthesized. It was shown that AS, JB and glycyrol induced cancer cell death with the morphology of apoptosis and autophagy. The apoptosis-inducing effect was characterized by annexin V/propidium (PI) staining, increase of sub-G1 phase, PARP-1 cleavage, and caspase-3 activation, while the autophagy-inducing effect was indicated by the formation of cytoplasmic vacuoles, acridine orange staining, and microtubule-associated protein 1 light chain-3 II (LC3-II) conversion. The mechanism studies showed that the autophagy inhibitor bafilomycin A1 (BaF) decreased AS-induced cell death, p38/c-Jun N-terminal kinase (JNK) activation and caspase-3 activation, but caspase-3 inhibitor Ac-DEVD-CHO did not affect LC3-II accumulation or AS-induced cell viability, suggesting that AS induced autophagic cell death and autophagy contributed to caspase-3-dependent apoptosis. BaF increased JB-induced cell death, pp38, pJNK, FasL, caspase-8 activation and caspase-3 activation, suggesting that JB induced protective autophagy to retard extrinsic pathway-mediated apoptotic cell death and the combination of JB with autophagy inhibitor might improve its antitumor therapeutic effect. Glycyrol was demonstrated to induce DNA damage and G0/G1 phase cell cycle arrest indicated by the increase of phosphorylation of Chk1 (Ser345)/Chk2 (Thr68) and p21. Furthermore, JNK/p38 MAPKs activation induced caspase-dependent apoptosis accompanied by protective AMPK activation that promoted autophagy induction. However, defective autophagy was triggered through lysosome deacidification, which stopped the autophagic flux by the slowing of lysosomal degradation. In addition, glycyrol suppressed tumor growth in the nude mouse tumor xenograft model bearing HCT 116 cells. Taken together, these results demonstrate that AS, JB and glycyrol might serve as potential candidates for cancer therapies, and clarify the role of apoptosis and autophagy in natural products-induced cell death is crucial for theirs usages.