Metabolic engineering of Raoultella ornithinolytica B6 for enhanced production of 2,3-butanediol

Abstract

석유 고갈과 이로 인한 석유 산업을 기반으로 생산하는 화학물의 경제성, 그리고 환경 문제에 대한 관심이 증가함에 따라 생물학적 방법을 통한 유용물질 생산에 대한 관심은 날로 증가하고 있다. 그 중에서도 2,3-butnaediol (2,3-BD)은 생물공학적 방법을 이용해 생산이 가능하며 그 활용도가 높아 생산 가능한 미생물과 발효 공정에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 그러나 독보적으로 높은 생산성을 보이는 미생물은 Klebsiella 종에 속하는 박테리아로 해당 미생물들은 병원성을 갖고 있어 산업적 측면에서 안전성 문제를 갖고 있다. 한편, 바이오디젤 생산 증가에 따라 부산물로 생산되는 글리세롤의 가격이 꾸준히 낮아지고 있음에도 불구하고, 고수율의 2,3-BD 생산을 위한 탄소원으로 글리세롤을 채택하여 진행한 연구는 당류를 활용한 연구에 비해 상대적으로 미진하다. 이에 따라 본 연구는 당 뿐만 아니라 글리세롤을 탄소원으로 이용하여 효율적인 2,3-BD의 생산이 가능한 새로운 미생물을 제시함으로써 2,3-BD의 산업적 생산에 적용 가능한 탄소원의 다양화 및 균주의 다양화를 목적으로 한다. 이를 위해 유류 오염 토양 샘플에서 미생물을 분리, 동정하였으며, Raoultella ornithinolytica B6 라 명명하였다. 본 균주는 다양한 6탄당 (포도당, 과당, 갈락토스)과 5탄당인 자일로스, 이당류인 수크로스, 그리고 글리세롤을 활용하여 2,3-BD를 주요 생산물로 생산할 수 있다는 것을 확인 하였다. 이에 R. ornithinolytica B6 균주를 이용한 2,3-BD 생산성 향상을 위해 먼저 최적 발효조건을 탐색하였다. 당류 중에서는 가장 높은 수준으로 2,3-BD를 생산할 수 있도록 하는 기질인 포도당을 주요 기질로 하여 최적 배양 온도를 확인 하고, 유가식 회분배양 조건을 확립하였다. 먼저 pH 조건을 확립하였는데, 초기 pH 7.0 에서 배양하여 5.5에서 유지하는 이단계 조절 전략을 사용하여 2,3-BD 생산성을 향상시켰다. 그 다음으로는 교반속도를 조절하여 공기공급량을 조절하였다. 결과적으로 400 rpm의 속도로 교반할 때 2,3-BD (68.3 g/L)를 가장 높게 생산하는 것을 확인할 수 있었다. 다음 단계로 2,3-BD 생산량을 높이기 위해 대사공학적 방법을 통한 균주 개발을 수행하였다. 피루빈산의 2,3-BD로의 전환에 관여하는 세 개 유전자 (budA, budB, budC)가 과발현 된 균주 R. ornithinolytica B6(pBbA5c-budABC)는 앞서 확립한 최적 발효조건 하에 최종적으로 112.5 g/L의 2,3-BD를 생산하여 기존에 알려진 2,3-BD 생산 균주와 견주어 손색이 없음을 증명하였다. 한편, R. ornithinolytica B6 의 유전체 분석을 통해 글리세롤을 기질로 공급 시, 2,3-BD 분리 정제에 문제가 되는 부산물인 1,3-propanediol (1,3-PD)을 생산하는 대사경로를 갖고 있지 않은 것이 확인되었다. 이에 따라 높은 경제성을 가진 재생 가능한 자원인 폐 글리세롤을 기질로 공급하여 2,3-BD를 생산하고자 하는 연구를 진행하였다. 전체적인 연구의 흐름은 당을 공급했을 때와 같이 최적 배양 온도를 확인하고 유가식 회분배양 조건을 pH 조절과 공기 공급 측면에서 확립하였는데, 당을 공급했을 때와 다른 점은 pH 조절 전략으로 pH 5.5 에서 고정하는 것이 아니고 pH 5.5를 하한값으로 설정하여 5.5 이상에서의 pH 변동을 허용하였다. 이는 인위적인 pH 의 변화가 2,3-BD의 생산성 향상에 영향을 미친다는 기존의 연구를 바탕으로 하지만, 해당 연구에서는 인위적으로 일정 시간 간격을 두고 일정한 폭으로 pH를 올려서 pH에 맥을 유발하였다면, 본 연구에서는 하한선의 설정만으로 자동적으로 pH의 파동이 유발되었다는 점에서 기존 연구와 차별화 된다. 그리고 이러한 pH 파동이 1차 대사산물로 생산되는 젖산에 의해 유발 됨을 lactate dehydrogenase 유전자의 삭제를 통해 규명하였다. 이 과정을 통해 확립한 발효 조건에서, budABC 과발현 균주 R. ornithinolytica B6(pUC18CM-budABC)를 이용한 글리세롤 발효가 수행되었다. 순수 글리세롤을 기질로 하여 89.5 g/L 의 2,3-BD를 생산하였으며, 폐 글리세롤을 기질로 하여 78.1 g/L를 생산하였다. 상술한 바와 같이 본 균주는 1,3-PD를 생산하지 않으므로 글리세롤을 탄소원으로 하여 2,3-BD를 생산하는 경우, 기질의 경제성뿐 아니라 분리정제 공정에 있어서의 경제성까지 확보할 수 있다. 본 연구는 기존에 발표되었던 균주와 다르게 생물안전도 1의 미생물인 Raoultella 에 속하는 균주를 2,3-BD의 산업적 생산을 위한 후보 균주로 제시함으로써, 2,3-BD 생산 균주 범위를 확장시켰으며, 최초로 R. ornithinolytica 의 대사공학 및 발효 조건을 확립하였음에 그 의의가 있다.

2,3-Butanediol (2,3-BD) is a platform chemical with wide ranges of industrial applications. Numerous studies have been reported with regard to metabolic engineering of microorganisms able to produce 2,3-BD and optimization of fermentation processes in an effort to improve 2,3-BD production. To overcome limitation in industrial applications caused by the pathogenicity of previously reported 2,3-BD producers such as Klebsiella pneumoniae and K. oxytoca, a non-pathogenic 2,3-BD producing bacterium, Raoultella ornithinolytica B6 was isolated from a soil sample of Baegun Mountain in Korea. The B6 strain produces 2,3-BD as a main product by using glucose, galactose, fructose, xylose, sucrose and glycerol as carbon sources. Notable physiological characteristics of R. ornithinolytica B6 were observed. Cell growth and 2,3-BD production were higher at 25 oC than those at 30 oC. The B6 strain has no gene encoding glycerol dehydratase, which converts glycerol to 3-hydroxypropionaldehyde, an intermediate of 1,3-propanediol (1,3-PD) biosynthetic pathway, hence the B6 strain cannot produce 1,3-PD, which may cause difficulty in 2,3-BD purification processes. 2,3-BD production by R. ornithinolytica B6 was improved by metabolic engineering and optimizing fermentation conditions including pH and aeration. First, production of 2,3-BD from glucose was conducted. For optimizing fermentation conditions, pH was controlled by the two-stages

initial pH was set at 7.0 and then the acidity was maintained at pH 5.5 after naturally decreasing to pH 5.5. As a result, 2,3-BD production was increased by a 1.5-fold compared with no pH-control. Optimum agitation speed for 2,3-BD production was also investigated for 300, 400 and 500 rpm. The highest concentration of 2,3-BD (68.3 g/L) was obtained at 400 rpm. Further improvement of 2,3-BD production in titer (112.2 g/L) and productivity (1.35 g/L/h) was achieved by overexpressing the homologous budABC genes directly involved in the conversion of pyruvate to 2,3-BD. Second, fermentation conditions for using glycerol as a carbon source were optimized for efficient 2,3-BD production. By evaluating the effects of agitation speed, and pH control strategy, optimum fermentation conditions for 2,3-BD production were found to be 400 rpm, and pH control with lower limit of 5.5. Notably, significant pH fluctuations which positively affected 2,3-BD production were generated by simple control of the lower pH limit at 5.5. In a fed-batch fermentation under those conditions, R. ornithinolytica B6 produced 79.3 g/L 2,3-BD, and a further enhancement of 2,3-BD production (89.5 g/L) was achieved by overexpressing the budABC genes. When pretreated crude glycerol was used as a sole carbon source, the engineered R. ornithinolytica B6 produced 78.1 g/L 2,3-BD with 0.42 g/g of yield and 0.62 g/L/h of productivity. The 2,3-BD titer, yield and productivity were the highest values among 1,3-PD synthesis-deficient 2,3-BD producers. This study demonstrates R. ornithinolytica B6 as a promising 2,3-BD producer, which can produce 2,3-BD at high concentrations from glucose and glycerol.